3種防御酶在水稻抗稻曲病中的活性變化

李小娟, 劉二明*, 譚小平, 肖啟明, 劉年喜, 王金輝

(1.湖南農業大學生物安全科學技術學院,長沙 410128;2.湖南省植保植檢站,長沙 410005)

水稻稻曲病(false smut of rice)又叫假黑穗病、綠黑穗病、黑球病、青粉病和豐收病,是水稻穗部的真菌性病害,其病原菌的無性階段為有絲分裂孢子真菌稻綠核菌[Ustilaginoidea virens(Cke)Tak],有性世代為子囊菌中的稻麥角菌(Claviceps oryzaesativae Hashiok)。該病害在世界產稻區都有發生[1],目前呈加重趨勢,它不僅降低水稻產量,嚴重影響稻米品質[2],而且產生的稻曲病菌毒素,對人、畜有毒,影響人、畜健康[3-4]。

目前對稻曲球的組織生化研究很少,與抗稻曲病相關的生化機制也未見系統的研究。代光輝等[5]報道,抗感病品種中都存在過氧化物酶和木栓質,而且差異不大,可能與抗病性無關;木質素和多酚類物質在抗、感2個品種中也都存在,且抗病品種中的含量明顯多于感病品種。木質素和多酚類物質可能在抗病中起著某種作用,有可能作為篩選抗病品種的一個指標。代光輝等觀察顯示,在稻曲球中存在能發出熒光的“蝴蝶”型結構,稻曲球內不含過氧化物酶、木栓質、木質素和單寧類物質。苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等防御酶在其他作物病害中對抗病性的影響有較多的報道[6-9]。

本試驗用稻曲病菌分生孢子接種不同抗、感病的水稻品種,測定水稻3種酶活性的變化情況,期望從有關酶的生化測定找到與抗病性相關的指標,為抗性鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試品種

在溫室內栽培12個抗感程度不同的水稻品種,用直徑20 cm、高35 cm的灰塑料桶栽培,每桶栽3株,3次重復。這些供試品種在田間抗性表現從感病到抗病依次為:紅蓮優6號、兩優培九、Ⅱ優58、Ⅱ優 416、新香優 207、汕優 46、威優 207、特優111、金優 191、汕優 63、K 優 817、威優 46。

1.2 接種體的培養

將分離得到的稻曲病菌厚垣孢子挑取到裝100 mL馬鈴薯蔗糖(PS)培養液的三角瓶中,在水平搖床上26℃黑暗條件下130 r/min振蕩培養7 d,產生的分生孢子用于接種,濃度為100×視野下200個孢子。

1.3 接種時期與方法

在水稻孕穗末期即破口前3～7 d,用注射器將接種體注射到水稻穗部。接種后溫室內用加濕器加濕,溫度控制為28℃。

1.4 取樣

分別在水稻孕穗末期接種前、接種后 1、3、5、7 d,剪取接種部位進行酶的活性測定。

1.5 與抗性相關的生化指標的測定方法

1.5.1 PAL活性的測定

參照Meyer等[10]的方法。稱取待測定材料各1 g,加入 10 mL預冷的酶提取緩沖液(含1 mmol/L EDTA、20 mmol/Lβ-巰 基乙醇和 1%PVP 的0.1 mol/L pH 8.7的PBS)勻漿,4 ℃、10 000 r/min離心20 min。上清液即為酶粗提液。取2.5 mL酶提取液,加50μL 0.6 mmol/L L-苯丙氨酸、100μL 0.1 mol/L p H 8.7的PBS,40℃保溫60 min,加入0.2 mL 2 mol/L的 HCl終止反應,測290 nm吸光值,以不加酶液的反應體系標定為 0,以ΔA290/(min·g)FW為一個酶活力單位。分別測定接種前 、接種后1、3、5、7 d 的抗病品種、感病品種和對照的A值,根據 A值,比較不同品種的苯丙氨酸解氨酶的活性情況。

1.5.2 POD活性的測定

參照Chance和Maehly[11]的方法進行測定,稱取1 g取樣材料,加入預冷的酶提取液10 mL(含1%PVP的 0.05 mol/L、p H 7.0的 PBS)勻漿,10 000r/min、4℃離心 20 min,上清為酶粗提液。在3 mL石英比色皿中加入2.8 mL過氧化物反應液(含0.015 mol/L H 2O2的 0.05 mol/L、p H 7.0的PBS)、0.2 mL過氧化物酶提取液,記其在240 nm的吸光值,測酶活,以不加酶液的反應體系標定為0,以ΔA240/(min·g)為一個酶活力單位。分別測定接種前、接種后 1、3、5、7 d各品種和對照的 A值,根據A值,比較抗病品種、感病品種及對照的過氧化物酶的活性變化情況。

1.5.3 PPO活性的測定

參照文獻[12]的測定方法,稱取1 g取樣材料洗凈、擦干并剪碎,加入8 mL冰冷的p H 5.6的檸檬酸-磷酸緩沖液,研磨成勻漿,4℃10 000 r/min離心15 min,上清液為酶提取液,取3.8 mL緩沖液,0.2 mL酶液,1 mL 0.1 mol/L的鄰苯二酚,37℃反應30 min,立即用20%的三氯乙酸終止反應,以不加酶液的反應體系標定為0,離心后于420 nm測定其A值,以A值變化0.01為一個酶活性單位。分別測出接種前、接種后 1、3、5、7 d各品種和對照的A值,根據A值,比較抗病品種、感病品種及對照的多酚氧化酶的活性變化情況。

2 結果與分析

2.1 PAL的活性變化

試驗結果如圖1,接種前各品種相差不大,接種后第1天抗病品種威優46的PAL活性增加了10.5/(min·g),K優817增加了8.9/(min·g);感病品種紅蓮優6號接種1 d后酶活性稍有下降,感病品種兩優培九酶活性也變化不大,以后幾天的酶活性都呈下降趨勢,且比接種前的還要低,但特優111、K優817、威優46要比接種前的稍高。在接種后1～3 d是酶的變化活躍期。

圖1 12個水稻品種接種稻曲病菌后的PAL活性變化

結果表明接種后抗病品種比感病品種的PAL活性增加快,酶活高峰期要高。

2.2 POD的活性變化

接種后各品種的酶活性都呈上升趨勢(圖2),尤其是威優46、K優817,接種后第1天酶活性增幅較大,ΔA240分別增加了 9.6、7.3/(min·g);過了高峰期后酶活性又緩慢下降;感病品種兩優培九、紅蓮優6號、特優111接種后酶活性變化不太明顯,只是緩慢上升。結果表明,接種后抗病品種比感病品種POD的變化要快,酶活高峰期要高。

2.3 PPO的活性變化

如圖3,接種前各品種的PPO活性相差不大,接種后第1天PPO活性達到最高峰,抗病品種威優46、K 優 817、汕優63增幅很大,ΔA420分別增加了0.062、0.056、0.055/(min ·μg),感病品種兩優培九、紅蓮優6號PPO活性增加緩慢。

結果表明,接種后抗病品種比感病品種PPO增加的幅度大,酶活高峰期要高。

3 討論

各水稻品種接種稻曲病分生孢子后,一些抗病品種如威優46、K優817的PAL、POD、PPO活性在接種后第1天達到最高峰,且變化幅度最大。一些感病品種如兩優培九、紅蓮優 6號接種后PAL、POD、PPO活性變化不很明顯,先有少許緩慢上升,然后慢慢下降。根據對12個抗感水平不同的品種接種后的PAL、POD、PPO活性的測定,可以看出抗病品種的這些酶活性在接種后迅速升高,變化幅度較大;而感病品種則比抗性品種的酶活性要低,接種后酶活性緩慢增加,有些甚至下降,變化幅度不明顯。有些品種的酶活性變化不穩定,如金優191田間表現為抗病,但接種后PAL、POD活性變化緩慢,PPO活性變化幅度大,原因需進一步研究。本試驗得出過氧化物酶與抗病性相關,與代光輝等[5]報道的可能無關不符;他報道的多酚類物質在抗、感2個品種中也都存在,且抗病品種中的含量明顯多于感病品種,在本文中得到進一步的證實。

與抗性相關的一些其他生化指標如代光輝等[5]提到的木栓質、木質素和單寧類物質等有待以后進一步研究,以獲得更好、更密切的與抗性相關的生化指標。

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