檢測痕量Hg2+的DNA電化學生物傳感器

戈 芳 曹瑞國 朱 斌 李經建,* 徐東升,*

(1北京大學化學與分子工程學院,分子動態與穩態結構國家重點實驗室,北京分子科學國家實驗室,北京 100871; 2三明學院化學與生物工程系,福建三明 365004)

檢測痕量Hg2+的DNA電化學生物傳感器

戈 芳1,2曹瑞國1朱 斌1李經建1,*徐東升1,*

(1北京大學化學與分子工程學院,分子動態與穩態結構國家重點實驗室,北京分子科學國家實驗室,北京 100871;2三明學院化學與生物工程系,福建三明 365004)

通過自組裝方法將修飾有二茂鐵基團的富T序列DNA分子(DNA-Fc)固定在金電極表面,得到了一種基于DNA修飾電極的電化學汞離子(Hg2+)傳感器.當溶液中有Hg2+存在時,Hg2+可與修飾電極上DNA的T堿基發生較強的特異結合,形成T-Hg2+-T發卡結構,使DNA分子構象發生改變,其末端具有電化學活性的二茂鐵基團遠離電極表面,電化學響應隨之發生變化.示差脈沖伏安法(DPV)結果顯示:DNA末端二茂鐵基團的還原峰在0.26 V(vs飽和甘汞電極(SCE))附近,峰電流隨溶液中Hg2+濃度的增加而降低;Hg2+濃度范圍在0.1 nmol·L-1-1 μmol·L-1時,電流相對變化率與Hg2+濃度的對數呈現良好的線性關系.該修飾電極對Hg2+的檢測限為0.1 nmol·L-1,可作為痕量Hg2+檢測的電化學生物傳感器.干擾實驗也表明,該傳感器對Hg2+具有良好的特異性與靈敏度.

生物傳感器;Hg2+;DNA; 構象變化; 示差脈沖伏安法; 電化學阻抗譜

近年來,許多無指示劑的傳感器引起了大家的廣泛關注和研究興趣[1-2],DNA電化學生物傳感器便是其中的一種.這類傳感器通過鍵合在DNA分子上電活性基團的電化學響應變化,對目標物可實現快速靈敏的檢測.已有報道的DNA電化學生物傳感器在疾病診斷、基因測序、食品安全、環境檢測、法醫鑒定和無機離子檢測等領域[3-6],均具有良好的靈敏度和選擇性.

由于生產技術的發展以及城市人口的迅速增長,環境污染逐漸演化成為一個重大的社會問題,特別是環境中的重金屬污染,對人類健康構成了很大的威脅.更為嚴重的是,一些重金屬及其化合物不能被微生物所降解,易于在活體中富集,不僅對環境中的生物造成毒害,還間接危害到人類的健康.汞是對人類健康和環境最具危害性的劇毒元素之一,人體中汞的安全濃度是0.1 μg·mL-1,當其濃度達到0.5-1.0 μg·mL-1時人體就會出現明顯的中毒癥狀,從而引發一系列神經、精神等方面的疾病.美國環境保護局(EPA)確定的飲用水標準中汞的濃度上限為10 nmol·L-1[7].因此,建立一種能準確快速測定痕量汞的方法具有重要的意義.

目前,測定痕量汞的方法主要有等離子體電感耦合質譜法(ICP-MS)[8-9]、陽極溶出伏安法[10-13]、熒光探針法[14-17]等.這些方法或者需要昂貴的儀器,較長的分析周期,或者需要復雜的樣品預處理步驟.和傳統的檢測方法相比,基于電極表面分子構象變化的電化學生物傳感器具有簡單、靈敏、快速、廉價等諸多優點,新型電化學生物傳感器的研究也日益受到重視.本文利用自組裝方法構建了檢測Hg2+的DNA電化學生物傳感器,通過電極表面DNA分子和Hg2+作用造成的構象變化,檢測溶液中的Hg2+濃度.首先,在金電極表面組裝修飾有二茂鐵基團的富T序列DNA探針,汞與探針分子的T堿基可形成THg2+-T發卡結構[18-19],從而使 DNA構象發生改變,通過DNA末端二茂鐵基團氧化還原電流的變化,實現了對痕量Hg2+的快速檢測.

1 實驗部分

1.1 試 劑

DNA序列:5′-S-S-TTCTTTCTTTCCCCCCTTG TTTGTT-NH2-3′(購自上海生工生物工程技術服務有限公司);二茂鐵甲酸(購自蘇州永拓醫藥科研有限公司,經重結晶純化);三羥甲基氨基甲烷(Tris,純度≥99.9%,購自北京欣經科生物技術有限公司);1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳化二亞胺(EDC,純度≥98.5%,購自Alfa Aesar公司);N-羥基琥珀酰亞胺(NHS,純度≥99.9%,購自Alfa Aesar公司);三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽(TCEP,純度≥99%,購自Sigma公司);亞鐵氰化鉀(K4Fe(CN)6,純度≥98.5%,購自Alfa Aesar公司);鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6,純度≥99.0%,購自Alfa Aesar公司).其他試劑均為國產分析純.實驗用水均為Milli-Q超純水系統制備(購自Millipore公司,美國).

1.2 儀 器

二茂鐵修飾DNA探針(DNA-Fc)的純化采用NAP-5分離柱(illustraTM NAP-5 Columns,購自GE Healthcare).電化學實驗采用三電極系統:工作電極為金電極(購自天津艾達科技發展有限公司,直徑3.0 mm),對電極為鉑片電極,參比電極為飽和甘汞電極(SCE).示差脈沖伏安法(DPV)和電化學交流阻抗譜(EIS)測定在CHI 650A型電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)及Potentiostat/Galvanostat Model 283和頻率響應儀FRD100(EG&G,Princeton Applied Research,USA)上進行.

1.3 實驗方法

1.3.1 二茂鐵修飾DNA探針(DNA-Fc)的合成與純化

二茂鐵修飾的DNA探針按文獻方法[20-21]合成并純化:

合成:用20 mmol·L-1磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖溶液(PBS,pH=5.4)配制1 mmol·L-1二茂鐵甲酸溶液,取500 μL二茂鐵甲酸溶液,加入50 μL 100 mmol·L-1EDC(二者的摩爾比為1∶10)和125 μL 100 mmol·L-1NHS,反應15 min.再取250 μL反應產物與250 μL DNA(5′-S-S-TTCTTTCTTTCCCCC CTTGTTTGTT-NH2-3′,100 μmol·L-1)反應2 h.

純化:先以20 mL 10 mmol·L-1PBS緩沖溶液(含1 mol·L-1NaCl)平衡NAP-5柱,加入386 μL合成DNA樣品,然后加入114 μL PBS緩沖溶液.之后再加入1 mL PBS緩沖溶液洗脫,接取流出產物.得到的探針DNA分子置于-20℃的冰箱中保存.

1.3.2 電極預處理

將金電極用Pirahna洗液(98%H2SO4與30% H2O2的體積比7∶3)浸泡30 min,再依次使用1.0、0.3和0.05 μm Al2O3粉末打磨,并用無水乙醇和超純水超聲清洗各5 min,使金電極表面成光滑鏡面.再將電極置于稀硫酸溶液中進行電化學處理,至金電極達到穩定的伏安圖[22].電極表面用高純N2吹干.

1.3.3 探針DNA在金電極表面的自組裝固定

取二茂鐵修飾的探針DNA溶液(約50μmol·L-1) 10μL,加入10μL三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽(TCEP,10 mmol·L-1),反應60 min,將雙硫鍵切斷.再加入480 μL PBS緩沖溶液(100 mmol·L-1),其中含有1.5 mol· L-1NaCl,0.1 mmol·L-1Mg2+,pH=7.4,將探針DNA濃度稀釋至1 μmol·L-1.取50 μL探針DNA溶液滴加到金電極表面,于4℃冰箱中自組裝16 h.依次用含有1 mol·L-1NaCl的PBS緩沖溶液(10 mmol·L-1, pH=7.4)和超純水淋洗電極表面以除去未組裝的DNA,得到自組裝DNA修飾電極.將電極浸入PBS緩沖溶液(100 mmol·L-1,含1 mol·L-1NaCl)中于4℃保存24 h,將其活化.

1.3.4 電化學檢測

示差脈沖伏安法(DPV)實驗條件:緩沖溶液為10 mmol·L-1PBS(pH=7.4),支持電解質為1 mol·L-1NaCl,掃描電位為0-0.5 V(vs SCE),階躍電位為25 mV,掃描速率為10 mV·s-1.交流阻抗法:頻率范圍從0.1 Hz到100 kHz,電解質溶液為2 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-,支持電解質為0.1 mol·L-1KCl.

2 結果與討論

2.1 DNA修飾電極的電化學表征

電化學阻抗譜是檢測生物分子修飾電極界面結構的有力工具[23-26].我們以[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-為探針,考察DNA生物傳感器在不同制備階段中界面阻抗的性質.圖1為二茂鐵DNA組裝前后金電極的電化學阻抗圖.用Randles和Ershler等效電路對阻抗譜進行擬合(圖1右上角),所得參數列于表1.其中Rs為電解質溶液電阻,Cdl為界面區間電荷產生的雙電層電容,ZW(Warburg阻抗)為電極反應受擴散步驟控制時的電解阻抗,Rct為界面發生氧化還原反應的電荷轉移電阻.從表中數據可見,金電極表面修飾前后的Rs基本一致,不受電極表面重構的影響.Rct的大小反映了電極反應的難易程度,是電極/電解質界面電子轉移動力學的特征參數.DNA組裝到金電極表面,其磷酸骨架上的負電荷阻礙了[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-負離子在電極表面的電子轉移,使得Rct從6.402×102Ω增大到2.014×104Ω,相差近兩個數量級,證實二茂鐵修飾的DNA探針已被固定到電極表面.

圖1 金電極修飾DNA探針前(a)后(b)的電化學阻抗譜圖Fig.1 Nyquist plot of gold electrode before(a)and after(b)modification with DNA-FcInset is the modified Randle′s equivalent circuit of Nyquist plot. electrolyte solution:2 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-+0.1 mol·L-1 KCl;Rs:electrolyte resistance,Cdl:double-layer capacitance, ZW:Warburg resistance,Rct:charge-transfer resistance

2.2 DNA修飾電極對汞的示差脈沖伏安(DPV)電流響應

圖2為自組裝電極與Hg2+作用后示差脈沖伏安法(DPV)測定其還原電流的變化.作用前DNA末端二茂鐵基團的 DPV還原電流為 2.5 μA;與 100 nmol·L-1Hg2+作用后,電流減小為1.75 μA,但峰電位(0.26 V)基本保持不變.

將DNA修飾電極浸入不同濃度的Hg2+溶液中,檢測修飾電極的DPV電流變化,如圖3所示.Hg2+在0.1 nmol·L-1-1 μmol·L-1濃度范圍內都有電化學信號的改變,還原峰值電流隨Hg2+濃度的增加相應地減小,而峰電位基本保持在0.26 V.以峰電流的相對變化率(i0-i)/i0(i0為無Hg2+時的峰電流,i為浸入Hg2+溶液后的峰電流)對Hg2+濃度的對數作圖,如圖4所示,(i0-i)/i0與lgcHg2+在該濃度范圍內呈良好的線性關系,線性系數R為0.97318,線性方程為i= 0.0783lgcHg2++0.5327.該修飾電極對Hg2+的檢測限為0.1 nmol·L-1.

表1 金電極的等效電路中各元件的擬合參數Table 1 Equivalent circuit parameters for gold electrode

圖2 DNA探針修飾電極浸入100 nmol·L-1Hg2+溶液中10 min前(a)后(b)的示差脈沖伏安圖Fig.2 Differentialpulsevoltammetry(DPV)responses of DNA-Fc modified electrode before(a)and after(b) being immersed in 100 nmol·L-1Hg2+for 10 min

2.3 干擾離子的檢測

為了測試該DNA生物傳感器對Hg2+的特異性,將DNA修飾的金電極分別浸在CaCl2、PbCl2、Mn(CH3COO)2、CuCl2、Al2(SO4)3、CrCl3、Zn(NO3)2、CdCl2等濃度為1 μmol·L-1的不同溶液中進行DPV檢測,結果如圖5所示.由圖可見,各種金屬離子(包括Pb2+、Mn2+、Ca2+、Al3+、Cr3+、Zn2+和Cd2+,Cu2+除外)的峰電流變化遠遠小于Hg2+,說明DNA修飾電極上的T堿基與Hg2+的結合有很好的特異性,其它金屬離子對Hg2+的檢測沒有干擾,因此該傳感器對Hg2+具有很好的選擇性.檢測結果中Cu2+的峰電流異常增大,可能是因為Cu2+與DNA有復雜的結合作用,使得DNA在電極表面上構象發生變化,這和文獻報道的結果[2]一致.

圖3 DNA探針修飾電極檢測不同Hg2+濃度的DPV圖Fig.3 DPV responses of DNA modified electrode immersed in different concentrations of Hg2+cHg2+/(nmol·L-1):(a)0,(b)0.1,(c)1,(d)10,(e)50,(f)100,(g)500,(h)1000

圖4 峰電流相對變化率((i0-i)/i0)與Hg2+濃度(0.1 nmol·L-1-1 μmol·L-1)對數(lgcHg2+)的關系Fig.4 Plot of relationship between peak current change ratio((i0-i)/i0)and logarithm value of Hg2+ concentration from 0.1 nmol·L-1to 1 μmol·L-1

2.4 DNA電化學生物傳感器的機理探討

針對DNA在金電極表面的自組裝結構有很多研究報道[27-28],一般采用的是小分子和DNA混合組裝的方法,來消除DNA和金電極基底之間的非特異性相互作用.在沒有小分子自組裝層的情況下,單鏈DNA結構柔韌易彎曲,暴露在外面的堿基很容易吸附在金電極的表面,其構象傾向于平躺在電極表面上.此時DNA末端的電化學活性基團更易接近電極表面,從而發生電子轉移,表現出較強的電化學響應.當DNA發生雜交后,原本暴露在單鏈外側的堿基通過互補配對轉移到分子內部,使其與金電極之間的非特異性相互作用減弱,末端電化學活性基團遠離電極表面,表現出明顯的響應電流變化.圖 6給出了傳感器工作原理示意圖,當將自組裝電極浸入目標Hg2+中,DNA中的T堿基與Hg2+結合,形成了T-Hg2+-T發卡結構,單鏈DNA剛性增強,導致鏈端二茂鐵基團遠離電極表面,電子傳遞受到抑制, DPV峰電流也相應地減小.

圖5 DNA修飾電極浸在1 μmol·L-1的不同溶液中DPV峰電流相對變化率(i0-i)/i0Fig.5 DPV peak current change ratio(i0-i)/i0of DNA modified electrode immersed in different solutions with concentration of 1 μmol·L-1

圖6 DNA電化學生物傳感器檢測Hg2+的原理示意圖Fig.6 Schematic illustration of DNA electrochemical biosensor for Hg2+detection S denotessulfhedrylattheterminalofDNA.

3 結 論

制備了末端帶電化學活性基團二茂鐵的巰基DNA探針,通過巰基與金的強鍵合作用,將其固定在金電極表面,得到單鏈DNA修飾電極.用電化學阻抗法對修飾電極進行了表征;利用DPV方法對目標Hg2+進行檢測.在不加其它指示劑條件下,該電極在相當寬的Hg2+濃度范圍內均有電化學響應,并且峰電流的相對變化率與Hg2+濃度對數在0.1 nmol· L-1-1 μmol·L-1范圍內呈現良好的線性關系,檢測限低達0.1 nmol·L-1,可作為痕量Hg2+檢測的DNA電化學生物傳感器.在干擾離子存在下該傳感器對Hg2+有特定的選擇性,能對水樣中痕量Hg2+進行快速檢測.本方法簡便、快速,在環境保護方面具有潛在的應用價值.

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April 6,2010;Revised:May 27,2010;Published on Web:June 4,2010.

DNA Electrochemical Biosensor for Trace Hg2+Detection

GE Fang1,2CAO Rui-Guo1ZHU Bin1LI Jing-Jian1,*XU Dong-Sheng1,*
(1Beijing National Laboratory for Molecular Sciences,State Key Laboratory for Structural Chemistry of Unstable and Stable Species, College of Chemistry and Molecular Engineering,Peking University,Beijing 100871,P.R.China;2Department of Chemical and Biological Engineering,College of Sanming,Sanming 365004,Fujian Province,P.R.China)

In this paper we demonstrated a novel type of electrochemical Hg2+biosensor based on a DNA-modified electrode.Ferrocenyl-modified T-rich DNA(DNA-Fc)molecules were synthesized for use as electrochemical probes. We then fixed these DNA-Fc probes onto a gold electrode surface by self-assembly.In the presence of Hg2+,the single strand DNA on the electrode surface turned to a thymine-Hg2+-thymine(T-Hg2+-T)hairpin structure.The ferrocenyl groups were kept away from the surface of the electrode,and this could be measured sensitively by differential pulse voltammetry(DPV).The results show a reduction peak of ferrocene at 0.26 V(vs saturated calomel electrode(SCE))and the peak current of DPV decreased with increasing the concentration of Hg2+.The rate of current change is linear with regards to lgcHg2+over a concentration range from 0.1 nmol·L-1to 1 μmol·L-1and with a detection limit of 0.1 nmol·L-1. A test for interference metal ions showed that this electrochemical biosensor based on a DNA modified electrode is highly sensitive and selective,and it can be widely used for trace Hg2+detection.

Biosensor;Hg2+;DNA;Conformational change;Differential pulse voltammetry; Electrochemical impedance spectroscopy

O646

*Corresponding authors.Email:lijj@pku.edu.cn,dsxu@pku.edu.cn;Tel:+86-10-62755948,+86-10-62760360.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20573008,50821061),National Key Basic Research Special Foundation of China(2006CB806102),and National Key Basic Research Program of China(973)(2007CB936201).

國家自然科學基金(20573008,50821061),國家重點基礎研究項目特別基金(2006CB806102)及國家重點基礎研究發展計劃項目(973) (2007CB936201)資助項目