芬太尼類化合物與阿片μ受體相互作用的分子對接與分子動力學模擬

李 博 劉 明 胡文祥,*

(1首都師范大學物理有機與藥物化學研究所,北京 100048;2首都師范大學生命科學學院,北京 100048)

芬太尼類化合物與阿片μ受體相互作用的分子對接與分子動力學模擬

李 博1劉 明2胡文祥1,*

(1首都師范大學物理有機與藥物化學研究所,北京 100048;2首都師范大學生命科學學院,北京 100048)

采用分子對接和分子動力學(MD)模擬方法研究了芬太尼類化合物與阿片μ受體的相互作用機制.先用AutoDock4.0程序將芬太尼類化合物對接到同源模建的阿片μ受體結構中,再用GROMACS程序包在水溶液體系中分別對12個芬太尼激動劑和阿片μ受體蛋白復合物進行了MD模擬研究,優化對接復合物的結構,最后利用MM-PBSA方法,在APBS程序中計算芬太尼類衍生物與阿片μ受體的結合自由能,計算出的受體配合物結合常數(Ki)與其實驗值吻合較好,并預測了化合物的活性排序.結果表明,復合物蛋白結構與空載受體蛋白結構有較大差異,特別是胞內區IL2、IL3和跨膜區段TM4骨架構象變化較大,不同的化合物對受體結構影響也有差異,活性較好的化合物會增加蛋白特定區域結構的柔性.芬太尼類化合物可能是通過和受體結合后誘導阿片μ受體構象轉變為活性構象,引起一系列的信號傳導激活G蛋白,從而引發生理效應.

分子動力學;芬太尼;阿片μ受體;分子對接

阿片μ受體是阿片受體μ、κ、δ三種重要亞型之一[1],目前這三種阿片受體的基因均已被克隆[2],研究發現阿片類選擇性激動劑激動脊上和脊髓μ受體能引起一系列生理效應[3],具體表現為止痛效應、犒賞效應、心率減慢、呼吸抑制、腸蠕動抑制、僵住癥和成癮性等[4].嗎啡為經典的阿片μ受體激動劑,納洛酮為其拮抗劑[5].阿片μ受體屬G蛋白偶聯受體(G protein couple receptor,GPCR),GPCR具有相同的基本結構,即有一個細胞外氨基端區域,七個跨膜域以及一個細胞內羥基端尾區[6].

芬太尼(fentanyl)學名為1-苯乙基-4-(N-丙酰苯胺)哌啶,為阿片類鎮痛藥,它的鎮痛效力約為嗎啡的100-180倍，哌替啶的550-1000倍[7],并具有毒性低、對循環影響小、時效短(15-30 min)、容易控制、術后自主呼吸恢復快等優點,故近年來越來越受到人們的重視.芬太尼、舒芬太尼和阿芬太尼等芬太尼類配體藥效增強、起效迅速、作用消失快,靜脈滴注容易控制止痛劑量、安全可靠[8].關于芬太尼類激動劑與阿片μ受體選擇性結合的分子作用機制的詳細研究報道不多,目前對芬太尼活性構象的報道[9]中發現,芬太尼結構中的N-苯乙基和N-苯基基團的取向對活性構象貢獻較大.本文采用芬太尼及本課題組設計的小分子配體與阿片μ受體蛋白進行分子對接和分子動力學模擬,以研究配體與蛋白間的疏水作用、氫鍵作用等關系,探討其分子作用機制,對輔助設計新型高效鎮痛劑和其他特殊用途的化合物有一定的意義.

1 模型和計算方法

1.1 蛋白結構來源

我們前期的研究結果與文獻報道基本一致[10],故阿片μ受體蛋白的三維結構采用Zhang等[11]用同源模建方法搭建的結構.該結構以具有高解析度的視紫紅激酶的X射線晶體結構為模板(PDB代碼為:1F88).一般的GPCR受體經過同源建模后需要進行分子動力學模擬優化,目前,GPCR受體的MD模擬方法有兩種,一種是先構建蛋白與脂水膜體系,然后用MD研究整個蛋白-膜-水體系.另一種是構建蛋白-水體系,主要用來研究配體結合性[12].本文采用后一種方法.

1.2 復合物結構對接與配體最優構象

在IBM IntelliStation POWER工作站上,采用AutoDock 4.0程序[13]對12個芬太尼受體激動劑小分子與阿片μ受體進行分子對接,對接參數:受體大分子的格點盒子大小為8 nm×8 nm×8 nm,格點間距為0.0375 nm,盒子中心位于受體中心,運用Lamarckian遺傳算法,將局部能量搜索與遺傳算法相結合,以半經驗勢函數作為能量打分函數,對小分子構象和位置進行全局搜索,對每個配體進行128次獨立的對接實驗.遺傳算法程序關鍵參數為ga_pop_size 300 ga_num_evals 2500000,ga_run= 100,最后依據最低對接能和成簇分析的情況,選取合理的受體配體結合模式作為初步的復合物結構.

1.3 分子動力學模擬后再次對接

將MD模擬后得到的受體再次與配體進行對接,復合物的結構取MD達到穩態后的平均構象,然后從復合物結構中提取出受體結構和配體結構,再以新得到的受體按1.2節中的方法進行分子對接操作.

1.4 復合物結構的分子動力學研究

用GROMACS程序包[14]分別在水溶液體系中對12個芬太尼受體激動劑和阿片μ受體蛋白受體復合物進行了分子動力學模擬研究.12個復合物結構為1.2節所述對接的結果.每個復合物的質心位于立方體盒子中心,選擇溶質原子到盒子壁的距離為0.7 nm,然后加入水分子,水分子選用SPC模型.采用GROMACS全原子力場,用2 fs積分步長,用最陡下降法進行了1000步的能量優化,然后在300 K下進行了10000步的限制性動力學優化,最后采用2 fs的步長,使用熱浴耦合使系統溫度保持在300 K,用Maxwell分布產生.每隔100步記錄一次軌跡.在MD模擬中,用PME(Particle-Mesh Ewald electrostatics)方法處理靜電作用,范德華相互作用截斷半徑取0.9 nm,用SUNWAY計算機集群并行計算模擬1200 ps,直到能量達到穩態為止.分別對蛋白環境和溶劑環境下激動劑與環境之間相互作用能進行系綜平均,從而計算出受體-配體結合自由能(ΔG)和結合常數(Ki).

1.5 連續介質模型MM-PBSA方法計算復合物結合自由能

采用了MM-PBSA(molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area)方法[15]計算復合物結合自由能,此方法采用分子力學和連續介質模型估算復合物的結合自由能,并采用修正后的Robert Yang的Perl腳本[16]處理構象,修正后的腳本排除了程序中讀取錯誤.

MM-PBSA方法的計算方程式:

式(1)可以分為氣相能量項和溶劑能量項,氣相能量項包含內能項(EMM)和熵部分(TSMM)項;溶劑能量項Gsolv可以分為極性(Gpolar,solv)和非極性(Gnon-polar,solv)項,見式(2).用MD模擬后提取能量文件中的蛋白-蛋白電性和van der Waals相互作用而得到EMM項.參考了文獻中的方法[17]考慮了在對接研究中不同復合物的熵相同而忽略了熵部分TSMM項.本文根據分子動力學結果,計算復合物加權協方差矩陣再計算其熵部分數值[14].極性和非極性項的計算則采用APBS軟件包[18],其電性項的參數grid-spacing取0.01 nm.使用GROMOS96 43a1力場參數設置原子電荷和半徑,探針半徑0.14 nm,復合物介電常數設為1,溶劑的介電常數設為80[19].非極性項Gnon-polar,solv采用溶劑可及表面(SSASA)方法計算:

其中γ=2.2 kJ·mol-1·nm-2,β=3.84 kJ·mol-1[20].每個復合物采用21個結合構象,選取方法如下:在全部1200 ps模擬中,選取最后200 ps為平衡狀態,即從1000 ps開始(包含1000 ps)取樣,間隔為10 ps,選取一個結構,至1200 ps結束,共21個構象[21],采用這21個構象的極性和非極性項的平均值作為計算值.

2 結果與討論

2.1 阿片μ受體蛋白結構特點

人類阿片μ受體蛋白有七個跨膜(TM)區段,屬于GPCR超家族.該受體由400個氨基酸殘基組成, TM2、TM3、TM7區和第2胞內環區(IL2)具有較高的同源性,而TM1、TM4、TM5區則同源性較低.第2胞內環和第3胞內環區(IL2和IL3)是蛋白結合區域,這些區域在三種阿片受體中的高度相似性表明有與蛋白相互作用的可能性.阿片μ受體與κ、δ兩種阿片受體結構的最大差異部分在氨基端、羧基端及第2、3胞外環區(EL2和EL3),這些區域可能是阿片受體配體結合區,是不同配體選擇性的結構基礎.該推測已經通過直接點突變得到證實[22].阿片μ受體三維結構見圖1.

圖1 阿片μ受體蛋白結構Fig.1 Protein structure of μ opioid receptor

圖2 芬太尼類衍生物與μ阿片受體對接構象Fig.2 Docking conformation of fentanyl analogs with μ opioid receptor

2.2 復合物對接及結合能的計算

通過對初步的分子對接結果分析,發現芬太尼配體分子間距離0.5 nm內的參與配體相互作用比較重要的氨基酸有TM1區段上的Asp114、Ala117;TM3區段上的氨基酸Ile144、Ser145、Asp147、Tyr148、Asn150、Met151;TM5區段上的氨基酸His226、Ile230、Tyr234;TM6上Trp293、Asn296、His297、Tyr300、Arg303;TM7區段上的氨基酸Cys321、Ile322、Gly325、Tyr326等,所有參加作用的氨基酸編號見表1.12個芬太尼類衍生物(包括已知活性在內的4個芬太尼類衍生物)和阿片μ受體蛋白的對接結果有多種取向和構象,按照對接能量排序,我們發現低能構象多集中于配體質子化的N原子正電中心,并與TM3上的Asp147電負性中心發生相互作用(如圖2所示),此外還有幾個主要的作用殘基,分別為TM1的Asp114,TM3的Asp147,和TM6的His297,其中Asp147與芬太尼類衍生物的哌啶季氨正電荷有電性作用,這些研究結果與現有文獻的報道[24]是一致的.

表1 各跨膜區段活性位點氨基酸Table 1 Amino acid of active pocket in transmembrane helices

圖3 羥甲芬太尼通過水分子的氫鍵介導的相互作用Fig.3 Interaction of ohmefentanyl with watermediate through extra-H-bond

表2 芬太尼及類似物與MD模擬后受體的再對接結果Table 2 Re-docking results of fentanyl analogs after MD simulation

表3 芬太尼衍生物與阿片μ受體相互作用自由能Table 3 Free energy of interaction for fentanyl analogs and μ-opioid receptor complex

通過MD模擬研究,我們還發現復合物蛋白結構與無配體受體結構有較大差異(圖2).因此,我們將MD模擬后得到的受體結構再次與各自配體進行分子對接研究,AutoDock 4.0再次對接后的計算結合能結果見表2.表2計算結果顯示,結合能除羥甲芬太尼(ohmefentanyl)外,其它與實驗活性排序一致.我們分析認為,羥甲芬太尼結構中額外的羥基通過水分子介導與Tyr148殘基形成氫鍵(見圖3),而在對接過程中這個溶劑分子引入的額外的氫鍵未給予考慮,從而羥甲芬太尼對接評分排序與實驗結果是不一致的.采用MM-PBSA方法,計算出的12個芬太尼類衍生物的結合自由能,以及與它們對接計算的結果對比見表3.

用MM-PBSA方法計算得到的結合自由能,不但能夠對抑制劑的結合強弱進行正確的排序,而且計算得到的數值和實驗數值能夠較好地符合.其中以芬太尼的計算結果最為接近,與本文前述AutoDock 4.0計算結果[13]相比較,MM-PBSA方法計算結果更為接近實驗值,但計算數據與實驗值仍略有偏差,除羥甲芬太尼外,計算值整體稍微偏高.

2.3 空載受體與復合物的MD模擬

2.3.1 空載受體的MD模擬

圖4 受體在2000 ps范圍的內能變化Fig.4 Internal energy fluctuation of the receptor in 2000 ps

圖5 受體蛋白Cα位置的序列位置(δ)的RMS變化Fig.5 RMS fluctuation with the position of sequence number(δ)for receptor αRMS:root mean square

空載受體蛋白在MD模擬過程中均方根偏差(RMSD)值是衡量體系是否穩定的重要依據,α碳(Cα)和骨架的RMSD值在初始的100 ps內變化大,隨后基本穩定.蛋白結構經過2000 ps的優化達到穩態.本課題中以空載受體蛋白在1200 ps平衡后的平均構象作為分子對接的基礎構象,研究了其內能的變化,如圖4所示.結果表明,體系的內能變化不大,在短期模擬后即達到穩定狀態,這可能是因為采用的初始結構已經進行了能量優化的原因,上述模擬結果表明我們所得系統已經達到了穩定狀態. MD模擬中的Cα空間位置均方根(RMS)漲落是反映分子內部運動特征及柔性的一個重要參數,RMS值越高,柔性越大,否則相反.從圖5所示的空載受體RMS圖可以看出,全部序列中有7個跨膜區段(分別以TM1-TM7標示)柔性相對胞內(標示為IL)比胞外區(標示為EL)低,其TM4、TM5跨膜區氨基酸在平衡態時仍有一定的柔性.受體蛋白的柔性可用Cα序列位置(δ)的RMS變化來衡量,即觀察蛋白的δ在模擬后與模擬前結構的變化,用位置偏離的RMS均方根偏差來衡量,如果δ的RMS變化較大,說明這些區段的柔性較大.如圖6所示.

2.3.2 復合物模擬結果及不同配體復合物模擬結果差異

圖6 受體蛋白骨架在2000 ps內的RMSD變化Fig.6 RMSD change of receptor protein backbone in 2000 psRSMD:root-mean-square deviation

圖7 受體配體復合物在MD模擬期間能量(a)和骨架碳的RMSD(b)的變化Fig.7 Energy(a)and RMSD fluctuation(b)of receptor-liqand of complex C backbone in MD simulation

如圖7所示,以芬太尼受體復合物為例的所有復合物分子的模擬,總能量和勢能都很快達到穩態狀態.在開始的500 ps內,RMSD變化稍大,500 ps后通過RMSD值變化可知,已基本達到平衡狀態(圖7(b)).這說明復合物體系已經穩定.分析復合物的RMS數據(圖8)發現,受體柔性較大的片段為TM1、TM4、TM5跨膜區段,而對活性口袋具有主要貢獻的TM2、TM3、TM6、TM7跨膜區段,結構柔性較低,比較穩定.

將芬太尼復合物蛋白部分在1200 ps內的Cα與空載配體受體結構Cα比較得知,復合物跨膜區段IL2、IL3(胞內區段)和TM4區段構象變化較大.分析復合物的RMS變化(圖8、圖9),發現結合配體后,受體TM1、TM3、TM6、TM7區段柔性降低(圖8),而IL2、IL 3(胞內區段)EL3(胞外區段)和TM4的部分區段柔性增加,這說明配體能夠穩定受體TM1、TM3、TM6、TM7的構象,通過改變增加部分區段構象和柔性來激活受體,配體對受體結構的影響不僅僅在活性區,可能還通過一系列構象和柔性變化影響到整個受體的功能,從而使蛋白轉變為活性構象而發揮作用.我們前期通過構效關系和受體分子藥理學研究[26-29]表明,受體蛋白活性中心的變化影響生理活性的大小,最可能僅對剛性受體而言是正確的.本研究表明,對大多數柔性受體來說,非活性中心構象的變化也將影響整個受體的活性構象及其與藥物分子的相互作用,影響到藥物分子的生物活性.

圖8 芬太尼復合物的RMS變化Fig.8 RMS fluctuation of fentanyl complex

圖9 芬太尼復合物與受體骨架碳的RMS變化比較Fig.9 Comparison with RMS fluctuation of the fentanyl complex and receptor backbone C

圖10 對接評分高的復合物骨架碳的RMS變化Fig.10 RMS fluctuation of complex backbone C for high docking score complex

圖11 對接評分低的配體與受體結合后的RMS變化Fig.11 RMS fluctuation of low docking score after ligand binding receptor

不同配體的復合物結構RMS變化有差異. Carfentanil 24結合受體后,受體的TM6、TM7區段RMS變化小,結構更加穩定,而IL2、IL3、EL3、TM4部分區段的RMS較高(如圖10所示),實驗值較好的化合物在穩定TM6、TM7區段跨膜蛋白結構的同時,還增加了其他蛋白區段的柔性,這些區段柔性和構象的改變可能與蛋白功能有關.

與受體結合能較低的配體2、21、22與受體結合后,受體各個區段的RMS變化都呈下降趨勢,柔性降低(圖11).這種變化說明配體2、21、22與受體結合后,使得受體結構柔性整體降低,但是由于TM4、IL2、IL3柔性可能與活性構象有關,柔性整體降低不利于蛋白向活性構象轉變從而降低了活性.

2.3.3 結合配體后螺旋區的結構變化與蛋白活性構象

突變數據和分子對接的結果都表明TM2,TM3, TM7跨膜區段都參與了同配體的結合,因此有必要重點分析構成活性口袋的螺旋區結構變化.如圖12所示,分析結合配體后受體螺旋區的RMSD的變化,發現結合配體后受體TM4、TM5的RMSD波動較其他的幾個螺旋顯著.

圖12 受體與復合物蛋白結構的變化Fig.12 Change of structure with receptor and complex proteinstructures overlapping between receptor and complex(a), receptor(b),and complex(c)

表4 各跨膜區段結合配體后氫鍵數量的變化Table 4 Change of hydrogen bonds of transmembrane helices after binding with ligand

我們還分析了經歷同樣的MD模擬后,復合物和空載受體結構中氫鍵數量的變化,發現結合配體后,受體螺旋區的氫鍵除TM5區段外,其他區段的氫鍵數量稍有增加,特別是在TM4片段,比空載受體增加了兩對氫鍵的相互作用,這與RMS變化分析中結合配體后引發TM4區段的變化相一致,而結合配體后整個體系氫鍵的相互作用增加,復合物與空載受體氫鍵數量比為63比55,見表4.

在空載受體TM1和TM7、TM2和TM7、TM2和TM3、TM5和TM6與TM6和TM7之間都有氫鍵的形成.經過分析,這些螺旋之間形成氫鍵的現象在G蛋白偶聯受體家族中是普遍存在的.在結合配體之后,TM1和TM7、TM2和TM7、TM2和TM3、TM5和TM6跨膜區段之間的氫鍵作用消失,TM1和TM2、TM2和TM4跨膜區段之間的氫鍵作用增加,TM2、TM3、TM7是結合口袋所在的區域,我們推測這種氫鍵的消失和增加是受體活性構象所必須的.配體與Asp147、Tyr148、Ile322、Gly325、Tyr326等氨基酸殘基之間發生的相互作用打破了原有螺旋片段之間的相互聯系,引起幾個TM區段之間發生較大程度的相對運動,這種氫鍵作用關系的重構可能是蛋白轉變為活性構象的重要因素.在配體分子進入受體后,直接影響的是TM2、TM3、TM7跨膜區段,而隨后影響的是TM4區段,這樣使得下游的信號分子轉變為活性的狀態,引起一系列的信號變化而激活G蛋白,從而引發生理效應.

3 結論

對一系列芬太尼類化合物與阿片μ受體蛋白進行分子對接,討論了各配體與μ受體進行對接后蛋白質的構象,在分子動力學模擬基礎上,采用MM-PBSA方法進行了自由能排序,得出了已知活性分子的排序,具有比較好的預測能力,并與實驗值較接近.

對復合物進行的分子動力學模擬研究發現,受體與小分子配體結合后影響了非口袋區的蛋白構象.從蛋白結構不同區段的RMS變化分析發現, TM4跨膜區段和EL1胞外區的構象改變較大,這是與傳統活性構象不同之處.

通過探討復合物與受體氫鍵的變化,發現與配體結合后,復合物氫鍵的數目較單一受體略有增加,原有的TM4區段的氫鍵關系有所變化,推測TM4區段氫鍵的變化可能是蛋白活性構象改變的重要因素.

用分子動力學模擬結果結合MM-PBSA方法計算自由能作為評分依據,能得到比較好的理論預測結果,這些為藥物分子設計提供了重要的理論基礎.

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May 8,2009;Revised:September 8,2009;Published on Web:November 25,2009.

Molecular Docking and Molecular Dynamics Simulations of Fentanyl Analogs Binding to μ-Opioid Receptors

LI Bo1LIU Ming2HU Wen-Xiang1,*
(1Institute of Physical Organic and Medicinal Chemistry,Capital Normal University,Beijing 100048,P.R.China;2College of Life Science,Capital Normal University,Beijing 100048,P.R.China)

Weperformedmoleculardockingandmoleculardynamics(MD)simulations to investigate the interactions between fentanyl analogs and μ-opioid receptors.The AutoDock 4.0 program was used to perform the docking and homology modeling of the μ-opioid receptor structure.MD method as implemented in the GROMACS program was used to model the twelve fentanyl receptor agonists and the μ-opioid receptor protein compounds in water and to optimize the docking complex structure.Based on MM-PBSA methods,the APBS program was used to calculate the binding affinity of the complexes and the binding contant of receptor and liqand(Ki)values determined using MMPBSA were consistent with the experimental values.Our predictions of compound activity sequences were,therefore, correct.The MD simulations of these complexes revealed that the protein structures in the complexes differed substantially from the structures of the ligand-free receptors.The backbone of the intracellular region segments IL2, IL3 and TM4 showed that the skeleton conformations had changed significantly.Different compounds may influence the receptor structure differently.Compounds with high activities may enhance binding flexibility in certain protein structural regions.These facts imply that fentanyl analogs may result in μ-opioid receptors changing to an active conformation after receptor binding.Physiologic effects may thus be triggered by a mediating signal transduction and by the activation of the G-protein.

Molecular dynamics; Fentanyl; μ-opioid receptor; Molecular docking

O643

*Corresponding author.Email:huwx66@163.com;Tel:+86-10-68904756.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20872095).

國家自然科學基金(20872095)資助項目