果實褐變研究現狀及發展方向

張海新，寧久麗，及 華

（1.河北政法職業學院園林系，石家莊 050061;2.河北省廊坊市林業局，廊坊 065000；3.河北省農林科學院遺傳生理研究所，石家莊 050051）

褐變是園藝產品中普遍存在的問題，是果實品質劣變最明顯的特征之一，不僅影響果品的外觀、風味、營養，而且已成為貯藏加工的主要障礙。全世界每年因褐變造成的果蔬損失超過總損失量的50%[1]。果實褐變與采收后成熟老化生理衰退密切相關。R M Smock等[2]在蘋果貯藏保鮮研究中發現有7類生理失調反應，包括凍害、冷害、組織衰老、缺鈣、高CO2、低O2、機械損傷等均能引起果實褐變，由此可見，造成果實褐變的原因來自多方面。果實褐變可分為兩大類，即非酶褐變和酶促褐變。非酶褐變是由各種非酶原因引起的化學反應而造成果肉或果皮褐變，多酚物質自動氧化隨后聚合也可產生褐色物質引起褐變；酶促褐變是組織內的酚類物質在酶的作用下氧化成醌類，醌類再聚合形成褐色物質而導致組織變色。由于果實褐變多以酶促褐變為主，因此，一直是采后研究的重點。

1 酶促褐變的生化條件

1.1 底 物（酚類物質）

果實中酚類物質是酶促褐變的主要因素，引起褐變的酚類物質有100多種，可分為肉桂酸衍生物、類黃酮化合物、單寧和多巴胺4大類，主要是由碳水化合物代謝衍生出來的產物。雖然酚類物質種類繁多，但除了類黃酮外，多數酚類物質的生物合成均來自共同的前體物質苯丙氨酸，其它部分由乙酞-COA經聚酮酐途徑產生。酚類物質作為酶促褐變的底物有很多報道，杏果實中的酚類物質主要是綠原酸，褐變顏色的深淺主要取決于黃烷酮的含量[3]。桃果實中PPO的天然底物因品種不同而不同，大久保桃中PPO的最主要底物是咖啡酸,而綠化3號桃則是兒茶酚[4]。馬巖松等研究認為，綠原酸是南果梨褐變過程中的主要底物[5]，吳耕西等（1992）在鴨梨上同樣證明酶促褐變的底物是綠原酸。有研究認為，蘋果在生長期主要的酚類物質是4-甲基兒茶酚和表兒茶酸；蘋果采后貯藏過程中,主要的酚類物質是綠原酸和咖啡酸[6]?？梢?，不同種類的果實酶促褐變的底物不同，同一類果實在不同的生長發育階段其底物也有可能不同。

1.2 與褐變有關的酶類

國內外的研究一致認為，與酶促褐變密切相關的酶類主要是多酚氧化酶(PPO)，它是一種含銅離子的膜蛋白酶，大多存在于細胞中，有的也存在于細胞膜與細胞壁中。PPO所能引起的反應常會使果肉褐變，產生異味，并造成營養成分損失等。PPO能夠催化兩類不同的反應：一類是一元酚羥基化，生成相應的鄰二羥基化合物；第二類是氧化鄰苯二酚生成鄰苯醌,兩類反應均是需氧反應。L Marques等（1995）對PPO進行分離純化鑒定后認為，PPO有幾種不同的存在形式，其中最重要的一種相對分子質量為64 000[8]。在未成熟的果實中，有活性的PPO大多存在于果心部位[7],T Wakayama（1995）研究表明，果心處的PPO活性最高，其次是果肉，最后是果皮,這與果實從果心向果皮褐變的過程吻合。研究還發現PPO有同工酶存在，依據是在不同pH環境條件下PPO的活性出現兩個以上的峰值[4,8]。對分離的PPO同工酶性質進行分析發現，同工酶間的性質差別較大。關于PPO活性最適宜的pH環境，研究結果存在爭議。T Wakayama（1995）研究認為，pH 3.8最適宜,而其他人研究則認為pH 6.2[9]或pH 5.6[4]最適宜。而對PPO熱穩定性的研究結果相對比較一致，在 60 ℃以上仍有部分活性[8，9]。

1.3 氧

氧氣是生物生命活動的主要參加物質，也是生命活動中不可缺少的。正常的果實是完整的有機體，具有天然氧的屏障系統，植物組織通過表皮、氣孔、皮孔、細胞間隙等氣體交換系統完成植物生命過程的氧氣需要，多余的氧氣被排斥在組織以外，使組織與氧隔絕不褐變，說明植物組織具有很好的保護系統。有研究發現，代謝過程產生的活性氧是酶促褐變的主要需氧條件，O2-和H2O2是生物體內主要的活性氧。O2可還原基質，也可使基質氧化,H2O2在需氧的活動部位產生,并主要作為氧化劑。

2 酶促褐變的生理機制

果實褐變是一個復雜的生理活動過程，盡管前人進行了大量研究，但目前仍然不能確切闡明其生理變化機理。研究人員先后提出了多種學說理論，其中酚-酚酶的區域化分布學說是目前比較被接受的解釋酶促褐變的學說之一。有研究發現，果實中的酚類物質與PPO存在著區域性分布，正常的植物組織不發生褐變主要與細胞內酚類物質和酶的區域化分布有關。鞠志國等（1988）研究證實，萊陽茬梨果實中酚類物質貯存和積累在液泡中，但不含PPO，PPO主要集中在細胞質中，也有存在于細胞膜和細胞壁上，證明了PPO與多酚的區域性分布。酚類物質與PPO的區域性分布保護了組織細胞的正常生理活動，從而防止了褐變的發生。假如果實在貯藏期間或采前生理失調，就有可能打破這些物質的區域化分布,使酶和底物相互接觸，導致褐變的發生。

研究還發現，果實褐變的發生與清除活性氧自由基的超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性下降以及膜脂過氧化產物丙二醛（MDA）和H2O2的增加有密切的關系。蔣躍明等（1991）對香蕉褐變進行研究,證實了膜脂過氧化作用參與香蕉的褐變過程。低溫條件下香蕉果皮PPO活性增高與游離態PPO比值增大，褐變伴隨細胞還原勢迅速降低，液泡膜和質體膜結構破壞，組織內過氧化物含量增加有關。另外，外源H2O2和抗氧劑處理對果皮褐變和過氧化物含量分別起到促進與抑制作用，說明褐變機理不只是PPO參與的酚類物質氧化過程，還包括了細胞氧化還原代謝失調和細胞結構的破壞。

3 引起果實褐變的主要因素

3.1 冷 害

許多原產于熱帶、亞熱帶或高溫季節成熟的果實，在不適宜的低溫條件下貯藏，往往會發生冷害，冷害發生的主要癥狀之一就是組織褐變。盡管冷害的發生機理目前還處在不斷探索階段，但相關研究一致認為，冷害會導致細胞膜受傷害。在冷害溫度條件下，細胞膜系統發生相變，不飽和脂肪酸和磷脂含量比例下降，膜脂由液晶態轉為凝膠態，細胞膜收縮產生裂痕，致使透性增加，透性變化直接擾亂細胞內的離子平衡，造成離子外滲，也就打破了細胞內多酚與PPO的區域化分布。這樣，一方面會引起細胞的代謝失調且影響其正常的生命活動；另一方面代謝的中間產物如丙酮、乙醛、乙醇、多酚等會增多并累積，這又會進一步加快組織細胞的衰老和崩潰。但這種影響在短期低溫內是可逆的，如果在長期低溫條件下，細胞膜將發生不可逆的相變，這些有毒物質可使細胞受害，出現冷害癥狀。

3.2 氣體傷害

通常低O2與高CO2等不適宜的氣體成分會造成果實的褐變。果實置于O2濃度在1%～3%的環境中貯藏比較適宜。蘋果在低氧的條件下，果皮表面會產生褐色斑，果肉形成褐色的軟木斑和空洞，進而導致腐爛發生。亞洲梨在0℃、O2濃度為1%的條件下貯藏4個月，果實表皮會出現青銅色凹陷，鴨梨和雪花梨在0℃、O2濃度為1%的條件下貯藏4個月，果實表皮也會發生褐變[10]。高CO2環境下無論低溫或常溫貯藏，都會造成果實傷害，主要表現為果肉硬化、品質衰敗、產生異味。此外，還可使琥珀酸、丙氨酸積累，延胡索酸、天冬氨酸減少，呼吸代謝的三羧酸循環系統受到破壞，使果實正常生命活動難以完成，造成有害物質積累和細胞膜傷害，從而發生酶促反應，使組織產生褐變。氣體傷害引起的褐變與果實種類、采收時間、貯藏溫度、貯藏時間等因素相關。

3.3 礦物質元素缺乏

有關研究表明，果樹生長期間或采收后用無機鹽處理會抑制褐變的發生或減輕褐變，但無機鹽防止褐變的機理尚未清楚。果實在生長發育過程中，缺乏礦物質元素會影響生命活動的完成，出現生理失調，尤其是某些生物體內含量較少且不可取代的物質，對果實的生長發育和正常代謝具有明顯的影響。例如果實鈣素匱乏則細胞壁形成受阻，系統形成不完整，或不能與果膠酸結合成果膠酸鈣而使果膠酸過多，造成細胞壁破壞和分解，使質膜呈片斷狀或局部松馳，細胞壁厚薄不均勻，細胞膜系統極易遭受破壞，導致褐變發生[2]。

3.4 果實成熟度與果實大小

成熟度對果實與果肉的褐變影響很大，采收期的早晚對酶促褐變的影響可能是組織衰老和自身保護酶系統互相作用的結果。經研究表明，晚采收的桃果實比早采收的桃果實容易發生褐變。不同大小的果實在貯藏過程中的褐變程度不同，一般大果實比小果實易發生褐變，原因可能與貯藏后期果心釋放出來的CO2不能及時排出有關。

4 防止果實褐變的技術措施

4.1 貯藏溫度調控

冷害是引起果實褐變的重要因素，采用熱處理和間歇加溫等溫度調節措施可以有效地預防或減少冷害褐變的發生。采后熱處理可以改善由于冷害引起的細胞壁物質代謝的異常，并可誘導合成小分子量的熱激蛋白，減輕或抑制冷害的發生；同時熱處理還可降低某些氧化酶如苯丙氨酸氧化酶、多酚氧化酶與過氧化物酶的活性，抑制組織褐變，改善貯藏品質。筆者經研究證實，采用50℃熱水處理可以明顯地延長冬棗和贊皇大棗的貯藏保鮮期；羅自生等研究發現，熱激處理可以減輕柿果實冷害癥狀，顯著降低低溫冷害[11]。

目前，研究較多的變溫模式為間歇加溫，即冷敏感性果蔬在低溫貯藏期間采取多次短期升溫處理，使組織代謝恢復正常，可延緩甚至避免冷害的發生。D M Dawson等（1995）對桃果實和油桃果實進行間歇升溫處理來延緩冷害發生，延長貯藏壽命。都鳳華等（1994）研究表明，間歇加溫可有效地降低李子果實呼吸強度和乙烯釋放量，抑制冷害的發生。許多研究證明，間歇升溫對梨、桃、檸檬、芒果、李等果實冷害發生均有一定的延緩作用。

4.2 氣體調節

調控貯藏果實的氣體環境是控制褐變的有效方法之一，目前采用的方式有氣調貯藏、減壓貯藏和自發氣調貯藏等。上述方法通過降低O2濃度而相應提高CO2濃度,使之達到適宜比例,防止褐變。鞠志國報道[12]，O2濃度在5%～10%時，CO2濃度與果肉褐變呈正相關；CO2濃度相同條件下,果實不受O2（5%～20%）濃度變化的影響。在桃果實貯藏過程中，控制其貯藏環境中適宜的O2和CO2濃度可以有效地延長貯藏期。減壓貯藏同樣也是創造一個低氧環境，促進果實內氣體成分向外擴散，減少代謝和有毒物質的積累而延緩衰老。但由于不同種類的果蔬在遺傳與生理方面存在差異,對貯藏環境中的O2和CO2濃度的反應也不相同。

4.3 化學藥劑處理

通過化學藥劑抑制果蔬酶促褐變過程可達到抑制或延緩果實褐變的目的。應用較多的化學藥劑主要有鈣處理、酸處理、抗氧化劑、植物生長調節劑、PPO抑制劑、基質甲基化法等。鈣處理主要是防止仁果類如梨和蘋果等果實的褐變。如雪花梨在常壓條件下浸泡于濃度為6%的CaC12溶液5 min或減壓條件下浸泡于濃度為4%的CaC12溶液2 min，均能使果肉酚類物質保持在較高水平，抑制PPO活性并維持細胞膜結構的完整性[13]。經研究發現，焦亞硫酸鈉、食鹽、EDTA、谷胱甘肽、檸檬酸、抗壞血酸、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、二氧化硫、硫磺等化學藥劑均有一定程度的抑制果實酶促褐變的作用。例如在防止甘薯的褐變中抗壞血酸效果最好，檸檬酸次之，0.20%檸檬酸+0.05%抗壞血酸為最佳組合，而氯化鈉效果稍差[14]。外源生長調節物質可以改變果實內源激素的平衡,進而調節果實的生理代謝，增強果實的耐冷性，減少褐變的發生，通常應用的生長調節物質主要有ABA、GA3、2,4-D、多胺等。王勇等研究發現，用ABA處理可減輕貯于8℃條件下香蕉的冷害與褐變[15]；田世平等用GA3和鈣處理冬雪蜜桃，顯著地減輕了貯藏期間果心的褐變程度[16]。國內外做了大量酶抑制劑的應用研究工作，探明不同植物中PPO的分子型、銅離子的存在狀態不同，對不同的抑制劑會產生不同的反應。研究結果表明，利用半胱氨酸抑制梨濃縮果汁以及蘋果、馬鈴薯的褐變，利用亞硫酸氫鈉保持荔枝的色澤等均可取得較好效果。有關PPO抑制劑的報道很多，但在生產應用方面還難以取得令人滿意的效果。

4.4 采前管理與采收期控制

果實成熟度越高，組織衰老越快，褐變也隨之加重，同時褐變與果樹栽培管理和果實營養水平也有一定關系。擬用于貯藏的果實要在充分長大、但尚未完全成熟之前采收，不同品種果實的最佳貯藏期存在明顯差異，同一品種不同采收期果實的處理方式也不同。筆者利用七成、八成、九成成熟度的黑寶石李進行低溫貯藏試驗，結果表明，八成熟的果實貯藏效果最好，七成熟次之，九成熟最差。

5 未來的研究方向

隨著生物技術的不斷發展與進步，通過基因工程培育抗褐變果蔬品種己經成為現實。C W B Bachem等（1996）通過農桿菌介導，分別將PPOcDNA片段和cDNA全長加上合適的啟動子，反向插入到馬鈴薯的染色體組內，成功獲得了抗褐變的馬鈴薯新品系，這一成功技術證明基因工程可以運用到果蔬抗褐變品種培育中。隨著生物化學和分子生物學的迅猛發展，尤其是酶純化技術、免疫技術、PCR技術、反義RNA技術等的成功應用，番茄、馬鈴薯、甘薯、菠菜、葡萄、菠蘿、蘋果、梨、桃、日本枇杷、中國木瓜、荔枝、茶樹等園藝植物的PPO基因已被克隆，有望進一步應用于蘋果、香蕉、梨等抗褐變果蔬的培育改良上，為控制果蔬等農產品的酶促褐變提供一條新途徑。

另外，對果實褐變因素進行深入研究，從分子水平搞清酶促褐變機理，有望為控制酶促褐變提供切實可行的新方法。

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