萬壽菊提取物對松材線蟲的毒殺作用

巨云為，樊培峰，奚月明，薛中官

（1.南京林業(yè)大學(xué) 森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點實驗室，江蘇 南京 210037；3.江蘇省南京市農(nóng)林局，江蘇 南京 210008；4.江蘇省連云港市林業(yè)技術(shù)指導(dǎo)站，江蘇連云港 222001）

松材線蟲病Bursaphelenchus xylophilus是松樹的一種毀滅性病害。該病自發(fā)現(xiàn)以來已經(jīng)迅速在中國絕大多數(shù)松林地區(qū)爆發(fā)，至今還沒有有效的防治方法，目前仍然以藥劑防治為主，但效果較差，且污染環(huán)境［1］。隨著人類文明程度的不斷提高，人們的環(huán)保意識及對自身生活質(zhì)量的要求也不斷提高，因此，使用高效低毒的藥劑來防治線蟲，特別是在蔬菜、茶葉、中草藥、花卉及園林植物上的應(yīng)用尤其顯得迫切。“生物合理性”農(nóng)藥的研制已成為當今農(nóng)藥研究領(lǐng)域的熱點，從植物的次生代謝物中尋找具有殺蟲活性的物質(zhì)，以獲得研制新型、環(huán)保、和諧殺蟲劑的模板化合物就是重要的途徑之一［2－6］。菊科Compositae植物是被子植物中最大的科，廣布全球，其中中國有240屬，特有29屬，占中國菊科野生屬總數(shù)的13.43%。菊科植物化學(xué)成分的復(fù)雜性和多樣性均居植物界之首，潛在著大量的殺菌、殺蟲活性成分，具有極高的研究價值和廣闊的開發(fā)利用前景［7］。本研究通過測定萬壽菊Tagetes erecta粗提物殺松材線蟲活性，從而為菊科植物源殺蟲劑開發(fā)與利用提供一定的依據(jù)，同時也為直接利用植物材料配制應(yīng)用農(nóng)藥提供幫助。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 松材線蟲 松材線蟲取自南京地區(qū)病死的馬尾松Pinus massoniana。用貝曼氏漏斗法分離病樹上的松材線蟲，在顯微鏡下經(jīng)人工挑取純化，接種在嚴格滅菌的長滿灰葡萄孢菌Botrytis cinerea的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約7 d后分離培養(yǎng)皿中的松材線蟲，用無菌水配制成含松材線蟲約100條·滴－1的松材線蟲懸濁液，備用。

1.1.2 供試材料 萬壽菊的花、莖和根等3個部分。

1.2 粗提物的制備

1.2.1 材料的處理方法 將收集得到的萬壽菊材料分成根、莖和花等3個部分，然后將這3部分分別洗凈，放在干燥箱中，在50℃的溫度下進行干燥處理。干燥完成后，將它們分別用Jw6312型粉碎機粉碎成細粉末狀。

1.2.2 粗提物的提取方法 取萬壽菊根、莖和花的粉碎物各100 g，分別將它們放在體積分數(shù)為99%的乙醇中室溫下進行浸泡處理，2 d更換1次乙醇浸液。先用400目網(wǎng)篩過濾1次浸液，然后再對過濾的浸液進行抽慮過濾。連續(xù)浸泡提取3次后合并提取液。最后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液進行減壓蒸發(fā)，得到3種黏稠狀（膠狀）粗提物。將得到的膠狀粗提物密封，放4℃冰箱中備用。

1.3 生測方法

1.3.1 藥液的配制 用分析天平準確稱取各種粗提物適量，用無菌水進行溶解，將各種粗提物分別配制成 1.000，0.500，0.100，0.050，0.010，0.001 g·L－1共 6個質(zhì)量濃度的溶液，備用。

1.3.2 浸泡生測法 取若干直徑2 cm的小玻璃培養(yǎng)皿，然后把各種藥液按不同質(zhì)量濃度取3 mL放入小培養(yǎng)皿中，各種提取物做4組平行組，用清水做為對照組。每個培養(yǎng)皿中加入大約100條松材線蟲，放在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h觀察記錄1次松材線蟲的死亡率，72 h后結(jié)束觀察［8］。

2 結(jié)果

2.1 提取物的粗提結(jié)果

稱量蒸發(fā)濃縮所得各粗提物質(zhì)量，計算粗提物得率。粗提物得率 =［濃縮所得粗提物質(zhì)量/取用的材料的質(zhì)量（100 g）］× 100%。

所得萬壽菊莖的乙醇粗提物為10 g，粗提物得率為10%。所得萬壽菊根的乙醇粗提物為8 g，粗提物得率為8%。所得萬壽菊花的乙醇粗提物為6 g，粗提物得率為6%。

2.2 粗提物的殺線活性測定結(jié)果

觀察并統(tǒng)計不同質(zhì)量濃度的各種粗提物藥液對松材線蟲的致死率，并采用直線回歸法計算毒力回歸方程以及半致死濃度C50。

2.2.1 萬壽菊各部分粗提物的殺松材線蟲活性測定結(jié)果 測定結(jié)果見圖1。

2.2.2 萬壽菊各部分粗提物的最終生測結(jié)果分析測定結(jié)果見表1。從以上圖1和表1，我們可以看出，萬壽菊的根、莖和花的粗提物對松材線蟲的毒殺效果都比較明顯，并且從圖中可以看出松材線蟲的致死率隨著粗提物藥液質(zhì)量濃度的增加也有增長的趨勢，其中萬壽菊根粗提物的殺松材線蟲活性最為顯著，0.1 g·L－1以上質(zhì)量濃度時，72 h內(nèi)的線蟲致死率在 90%以上，其半致死質(zhì)量濃度C50達到 0.006 3 g·L－1。

表1 萬壽菊各部分粗提物的生測結(jié)果數(shù)據(jù)分析Table 1 Data analysis about toxicity of marigold extracts against Bursaphelenchus xylophilus

圖1 不同質(zhì)量濃度萬壽菊各部分粗提物對松材線蟲作用Figure 1 Toxicity of marigold root against the nematode

3 結(jié)論與討論

通過本次實驗發(fā)現(xiàn)，萬壽菊的根、莖和花各部分的粗提物對松材線蟲都具有一定的毒性，其中根的粗提物最為顯著。隨著粗提物藥液質(zhì)量濃度的增加，對松材線蟲的毒性也有增加的趨勢，當質(zhì)量濃度達到一定程度的時候就可以全部殺死松材線蟲。并且發(fā)現(xiàn)，粗提物藥液對松材線蟲的抑制作用有隨著時間的延長而增強的趨勢。結(jié)合前人的研究和本次實驗，進一步說明了萬壽菊粗提物具有較強的殺松材線蟲活性，在防治松材線蟲病方面具有良好的應(yīng)用前景。

本次實驗只是對萬壽菊的根、莖和花的粗提物單一的進行了對松材線蟲毒性的測試，并沒有進行它們之間的混配實驗，而且并沒有對其粗提取物中所含的有效成分的進一步分離和鑒定，這些將是我們下一步研究的方向和重點。

萬壽菊具有同印楝Azadirachta indica，川楝Melia toosendan，煙草Nicotiana tabacum和魚藤Derris trifoliata等同樣的地位，成為從2 400種已記載控害植物中挑選出來的43種廣譜控害植物之一，被譽為 “控害的精華”［8－9］。萬壽菊化學(xué)成分包括噻吩類、精油、色素、黃酮及苷類等。隨后的研究又發(fā)現(xiàn)萬壽菊的提取物對多種線蟲和昆蟲有毒殺作用，并且對多種植物病原菌有明顯的抑制作用［10－11］。Zechmeister和Sease首次從萬壽菊花中分離出三聚噻吩和它的衍生物，并有人發(fā)現(xiàn)在紫外光（320～400 nm）照射下，噻吩類化合物對線蟲有生物活性。Uhlenbroek等測試了從萬壽菊根中分出的噻吩及合成噻吩對3種線蟲的活性，結(jié)果顯示萬壽菊中的殺線蟲活性成分是噻吩物質(zhì)。樂海洋在從萬壽菊中分離殺蟲物質(zhì)，進行光活化基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究時發(fā)現(xiàn)，中國生長的萬壽菊所含的殺蟲有效成分比國外的要高［11-13］，因此，中國的萬壽菊在生物農(nóng)藥研究方面有更好的研究價值。

［1］楊寶君，潘宏陽，湯堅，等.松材線蟲病［M］.北京：中國林業(yè)出版社，2003：1－9.

［2］蔡秋錦，羅婉珍，陳長雄，等.植物性殺線劑的提取與毒殺效果［J］.福建林學(xué)院學(xué)報，1998，18（4）：291－293.CAI Qiujing，LUO Wanzhen，CHEN Changxiong，et al.Study on extraction and killing effect of plant nematodicide［J］.J Coll Fujian For，1998，18（4）：291－293.

［3］潘宏陽.當前我國松材線蟲病的治理對策［J］.森林病蟲通訊，2000（6）：44－47.PAN Hongyang.Current countermeasures about pine wood nematode disease［J］.For Pest Dis，2000（6）：44－47.

［4］楊秀娟，何玉仙，陳福如，等.不同植物提取液的殺線蟲活性評價［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，24（3）：386－389.YANG Xiujuan，HE Yuxian，CHEN Furu，et al.Evaluation on nematicidal activity of different plant extracts［J］.Acta Agric Univ Jiangxi，2002，24（3）：386－389.

［5］趙博光.苦豆堿對松材線蟲病的殺線活性［J］.林業(yè)科學(xué)，1996，32（3）：243－247.ZHAO Boguang.Nematicidal activity of aloperine against pine wood nematode［J］.Sci Silv Sin，1996，32（3）：243－247.

［6］趙博光，高蓉，巨云為，等.抗生素對松材線蟲病的影響［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2000，24（4）：75－77.ZHAO Boguang，GAO Rong，JU Yunwei，et al.Effects of antibiotics on the pine wilt disease［J］.J Nanjing For Univ Nat Sci，2000，24（4）：75－77.

［7］李玉平，龔寧，慕小倩，等.菊科植物資源及其開發(fā)利用研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2003，31（增刊）：151－156.LI Yuping，GONG Ning，MU Xiaoqian，et al.A brief review on the Compositae resource and its utilization［J］.J Northwest Sci-Tech Univ Agric For Nat Sci Ed，2003，31（supp）：151－156.

［8］巨云為，畢慶泗，趙博光.苦楝提取物對松材線蟲的致死活性［J］.林業(yè)科技開發(fā)，2002，16（3）：26－27.JU Yunwei，BI Qingsi，ZHAO Boguang.Melia azedarach extracts on the lethal activity of Bursaphelenchus［J］.China For Sci Technol，2002，16（3）：26－27.

［9］王新國，徐漢虹，趙善歡.殺蟲植物萬壽菊的研究進展［J］.西安聯(lián)合大學(xué)學(xué)報，2002，5（2）：2－8.WANG Xinguo，XU Hanhong，ZHAO Shanhuan.Progress in insecticidal plant marigold，Tagetes erecta［J］.J Xi’an Unit Univ，2002，5（2）：2－8.

［10］王新國，徐漢虹，劉新清，等.4種菊科植物α-三連噻吩的含量測定及殺蟲活性研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，22（3）：26－28.WANG Xinguo，XU Hanhong，LIU Xinqing，et al.The analysis of α-terthienyl in Compositae plants and their bioactivity against Mosquito larvae［J］.J South China Agric Univ，2001，22（3）：26－28.

［11］吳云驥，周海梅，趙萍，等.萬壽菊化學(xué)成分的研究（I）萬壽菊揮發(fā)油的GC/MS分析［J］.信陽師范學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，2004，17（4）：417－419.WU Yunji，ZHOU Haimei，ZHAO Ping，et al.Analysis of the chemical composition of Tagetes erecta（I）analysis of the composition of essential oils in Tagetes erecta by GC/MS［J］.J Xinyang Norm Univ Nat Sci Ed，2004，17（4）：417 －419.

［12］樂海洋，趙善歡.萬壽菊提取物對白紋伊蚊幼蟲的光活化活性及有效成分研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998，19（2）：8－12.LE Haiyang，ZHAO Shanhuan.Photoactivated toxicities of extracts from Tagetes erecta to larvae of Aedes albopictus and analysis of their insecticidal principles［J］.J South China Agric Univ，1998，19（2）：8－12.

［13］崔德君.萬壽菊粗提物對小菜蛾的生物活性及作用機制研究［D］.廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，1997.CUI Dejun.Studies on the Mode of Action and Biologial Activities of the Crude Extracts from the Marigold（Tagetes erecta）to Diamondback Moth（Plutella xylostella）［D］.Guangzhou：South China Agricultural University，1997.