制備型高效液相法分離苦瓜抑菌活性成分

孟曉，馬力

（西華大學生物工程學院，四川 成都 610039）

制備型高效液相法分離苦瓜抑菌活性成分

孟曉，馬力*

（西華大學生物工程學院，四川 成都 610039）

選擇200目～300目硅膠為柱填料，以抑菌效果為評價指標，利用制備型高效液相法（Pre－HPLC）對苦瓜提取液浸膏中的抑菌活性成分進行分離。結果表明：當流動相配比石油醚（60℃～90℃）∶乙酸乙酯為7∶3，進樣量0.5 mL，流速5 mL/min時，檢測器在280 nm波長處所檢測到的物質抑菌效果最好，其對金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯，抑菌圈直徑為12 mm，對照組沒有抑菌效果。

制備型高效液相法；苦瓜；抑菌

苦瓜（Momordica charantia L.）又稱涼瓜，是葫蘆科苦瓜屬植物。據研究表明[1-3]，苦瓜作為一種藥食同源的瓜類蔬菜，具有增強免疫能力、抑菌、降血糖、抗癌、抗腫瘤、抗氧化、治療糖尿病、治療艾滋病等藥理作用。

近十幾年來，隨著人們對分離與純化技術的不斷探索，色譜分離技術得到了迅速發展，制備高效液相色譜法已成為當代高效分離技術的研究前沿，用于制備高質量的生物活性物質[4-5]。本文以抑菌效果為評價指標，采用制備型高效液相法（Pre－HPLC）對苦瓜提取液中的抑菌活性成分進行分離，旨在獲得具有較好抑菌效果的一類物質，為下一階段對該類物質相關性質的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

苦瓜粉：市場自購。

1.1.2 試劑

石油醚（60℃～90℃）、乙酸乙酯、無水乙醇、營養瓊脂：分析純，成都科龍化工試劑廠。

1.1.3 菌種

大腸桿菌（Escherichia coli），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由西華大學實驗中心提供。

1.1.4 儀器

AKTA Purifier10制備型高效液相色譜儀：GE公司；SHB-3循環水多用真空泵：鄭州杜甫儀器廠；RE-52B旋轉蒸發儀：上海亞榮生氏儀器廠；JY92-2D超聲波細胞粉碎儀：寧波新芝科器研究所；HH-S4數顯恒溫水浴鍋：金壇市醫療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

以70%乙醇為溶劑，采用超聲波輔助提取苦瓜粉，用二氯甲烷萃取提取液，水浴揮干溶劑，得苦瓜提取液浸膏；準確稱取苦瓜提取液浸膏0.50 g，無水乙醇溶解，配制成濃度為50 mg/mL的溶液，過0.45 μm的微孔濾膜，供分析和制備用。

1.2.2 色譜條件

自填硅膠柱（12 mm×300 mm，200目～300目）；流動相：石油醚-乙酸乙酯；流速5mL/min；檢測波長280nm；進樣量 50 μL。

1.2.3 洗脫液收集

采用制備型高效液相系統對按照1.2.1處理好的樣品在1.2.2的色譜條件下進行分離，按照出峰順序收集洗脫液，濃縮，揮干流動相，干燥備用。

1.2.4 抑菌效果評價

用無菌鑷子將滅菌后的濾紙片（6 mm）放入1.2.3的樣品液中，浸泡0.5 h后取出，揮發掉乙醇；吸取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌懸液于無菌平皿中，均勻地涂布于凝固的培養基表面；將含樣品的紙片貼于平板上，每種設3個重復，然后以無菌水作為對照，放入培養箱中，37℃下培養24 h。取出測定抑菌圈直徑，取其平均值。

2 結果與討論

2.1 樣品粗分離與抑菌效果比較

在流動相:石油醚-乙酸乙酯（9∶1）；流速 5 mL/min；檢測波長280 nm；進樣量50 μL的色譜條件下對1.2.1的樣品進行分離，得到色譜圖如圖1所示。

如圖1所示，利用上述色譜條件對1.2.1的樣品液進行分離后，在280 nm波長處共檢測到4個峰，其中1號峰和2號峰都是在流動相配比為石油醚：乙酸乙酯（9∶1）時洗脫下來的，說明這兩種物質都屬于弱極性物質；而3號峰和4號峰則是用無水乙醇洗脫下來的，因此這兩類物質可以歸為極性物質。最后，按照1.2.3的處理方法對各洗脫液進行處理，分別取等量各干燥樣品，等體積無水乙醇溶解，進行抑菌試驗。結果表明：在2號峰處收集的洗脫液抑菌效果最好，其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有較為明顯的抑制效果，其抑菌圈直徑分別為13 mm和12 mm。結果見圖2。

2.2 樣品細分離與抑菌效果比較

改變色譜條件，即流動相∶石油醚-乙酸乙酯（7∶3）；流速 5 mL/min；檢測波長 280 nm；進樣量 50 μL。在此條件下對2.1中的2號峰洗脫液進行再分離，得到色譜圖如圖3所示。

可知，利用上述色譜條件對2號峰的洗脫液進行分離后，在280 nm波長處共檢測到三個峰，其中2-1號峰和2-2號峰都是在流動相配比為石油醚：乙酸乙酯（7∶3）時洗脫下來的，說明這兩種物質都屬于弱極性物質；而2-3號峰則是用無水乙醇洗脫下來的，因此這類物質可以歸為極性物質。最后，按照1.2.3的處理方法對各洗脫液進行處理，分別取等量各干燥樣品，等體積無水乙醇溶解，進行抑菌試驗。結果見圖4。

圖4結果表明：在2-2號峰處收集的洗脫液抑菌效果最好，其對金黃色葡萄球菌有較為明顯的抑制效果，抑菌圈直徑為12 mm，但其對大腸桿菌沒有明顯的抑制作用。

3 結論

通過試驗表明，在不同色譜條件下對苦瓜提取液浸膏進行粗分離和進一步的細分離，最后在色譜條件為流動相∶石油醚-乙酸乙酯（7∶3）；流速 5 mL/min；檢測波長280 nm；進樣量50 μL時，從中分離得到2-2號峰收集到的洗脫液抑菌效果最好，其對金黃色葡萄球菌有較為明顯的抑制效果，抑菌圈直徑為12 mm，但其對大腸桿菌卻沒有明顯的抑制效果。分析其原因可能有兩點：第一，在該峰處收集到的抑菌活性物質的濃度還沒有達到抑制大腸桿菌生長的范圍，通過進一步增大其濃度進行抑菌試驗，仍沒有明顯效果；第二，該活性物質可能是與其它類物質協同作用起到抑制的效果，經過進一步的細分離之后，其它類物質被分離開，從而導致其失去抑制大腸桿菌生長的作用。

總之，運用制備型高效液相法對苦瓜提取液浸膏進行分離，分離高效快速，并且通過重復試驗證明該法具有很好的重現性，能夠得到抑菌效果較好的一類物質，以便于下一階段對該類物質的性質做進一步的分析研究。

[1]萬新建,陳學軍,纓南生.我國苦瓜的研究現狀及展望[J].江南農業學報,2002(6):46-50

[2]袁杰,杜琪珍.苦瓜中活性成分的初步研究[J].食品研究開發,2004(1):108-109

[3]向亞林,凌冰,張茂新.苦瓜化學成分和生物活性的研究進展[J].天然產物研究與開發,2005,17(2):242-246

[4]高明哲,袁曉艷,肖紅斌.制備型高效液相色譜法從積雪草提取物中分離純化積雪草甙和羥基積雪草甙對照品[J].色譜,2008,26(3):362-365

[5]王永祿,王麗瑤.制備型高效液相色譜法及其在中藥研究中的應用[J].中醫藥通報,2006,5(3):60-63

Research on the Antibacterial Activity Components of Momordica Charantia L by Preparative High Performance Liquid Chromatography

MENG Xiao，MA Li*
（School of Bioengineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China）

The antibacterial activity components of Momordica charantia L.were separated by the preparative high performance liquid chromatography （Pre－HPLC）.The result shows:the best antibacterial activity components were separated under the conditions of the petroleum ether（60 ℃－90 ℃）:ethyl acetate is 7∶3,0.5 mL of injection volume,5 mL/min of velocity,the detection wavelength is 280 nm.The Staphylococcus aureus was inhibited well and the Inhibition zone diameter is 12 mm.

Pre-HPLC;momordica charantia L.;antibacterial

孟曉（1983—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品生物技術。

*通訊作者

2009-08-13