多重RT-PCR方法檢測新型甲型H1N1流感病毒的研究

摘要:為了建立快速檢測新型甲型H1N1流感病毒的多重PCR技術，根據GenBank中公布甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)的HA和NA基因序列，設計并合成兩套特異性引物。使用TaKaRa公司的一步法RT-PCR試劑盒和自行設計合成的引物建立多重RT-PCR反應，按照預期的PCR產物序列合成的DNA作為陽性對照。結果表明，該方法具有良好的特異性，可以將甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)與傳統甲型H1N1、H3N2、H5N1、H6N2和H9N2亞型流感病毒區分。該方法同時具有較高的靈敏度，最低可以檢測到100個拷貝的陽性克隆質粒。在對183份發熱病人臨床咽拭子樣品檢測中發現了10份陽性樣品，對350份豬鼻腔拭子樣品檢測全部呈陰性，結果與中國檢驗檢疫科學研究院試劑盒檢測結果一致，說明了該多重RT-PCR方法在臨床檢測新型甲型H1N1流感病毒方面具有廣闊的應用前景。

關鍵詞:多重RT-PCR;甲型流感病毒;H1N1亞型

中圖分類號:S852.65文獻標識碼:B文章編號:1007-273X(2010)10-0008-03

流行性感冒病毒簡稱流感病毒(Influenza virus)，屬正黏病毒科(Orthomyxoviridae)。按其核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，NP)和基質蛋白(matrix protein，M)的不同，可將流感病毒分成甲(A)、乙(B)、丙(C)3型。甲型和乙型流感病毒可以引起大的暴發流行和嚴重疾病;丙型流感病毒與普通感冒有關，主要在兒童中流行[1]。其中甲型流感病毒根據其表層血凝素蛋白和神經氨酸苷酶蛋白分類成不同亞型，至今為止發現16×9種不同組合的甲型流感病毒亞型。其中影響人類最重要的流感病毒是H3N2亞型和H1N1亞型，前者往往會與非常大規模的高死亡率有關[2]。

流感病毒普遍被認為是有能力重組其抗原基因結構和創造新的病毒株，比如改變其毒力、傳染力或者宿主范圍這些生物學特性[3]。基因重組在兩個毒株之間發生是比較頻繁的，但也有可能摻雜來源于不同物種的RNA片段。新型甲型H1N1即是一株在2009年全世界的人類范圍中傳播而暴發的變種流感H1N1病毒，7月份美國疾控中心(The U.S. Centers for Disease Control and Prevention，CDC)病毒學家在一名病患身上分離到一株甲型H1N1病毒，發現這株病毒由4種不同流感病毒株基因重組而成，包含有人流感病毒片段、來自北美和歐亞大陸的豬流感病毒片段和來自北美的禽流感病毒片段，這類病毒之前未曾報道有從人類或者豬的身上分離得到[4]。

流感病毒在變異重組過程中不斷突破物種隔離和地理隔離的局限，在全世界范圍內傳播肆虐，給人類和家畜帶來嚴重的威脅。由于病毒發生了變異，以往的病毒疫苗和診斷檢驗檢疫技術已經不可以控制該病毒的傳播，建立快速的檢測方法從而進行早期診斷是有效防止疫情快速蔓延的方式之一。本研究根據GenBank中公布的甲型H1N1流感病毒2009年流行株的基因序列，設計了同時檢測HA和NA基因的多重RT-PCR檢測方法，期望為疫情的控制提供有力的技術支持。

1材料

傳統的甲型H1N1和H3N2流感滅活病毒由廣東溫氏集團股份有限公司贈送。H5N1、H6N2和H9N2亞型流感滅活病毒購自哈爾濱獸醫研究所。

新型甲型H1N1流感病毒陽性對照由上海旭冠生物技術有限公司合成，為甲型H1N1病毒2009年流行株HA和NA基因對應DNA序列。

2方法

2.1特異性引物的設計

在GenBank中搜索并獲取2009年甲型H1N1流感病毒流行株的HA和NA的基因序列，利用分子生物學軟件Clustal X進行多重序列比對，找到理想片段后用Primer Premier 5.0進行特異性引物設計，應用Oligo 6.0對引物評價分析。

為了滿足檢測新型甲型H1N1病毒的要求，引物的設計長度控制在15~30bp，引物擴增片段在300~

1 000bp之間，其G+C含量35%~60%，Ta值介于50~60℃。無發夾結構、二聚體、錯誤引發情況及上下引物之間二聚體形成情況，一對理想的引物應當不存在任何一種上述結構。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上利用BLAST功能對引物與其他基因進行同源序列分析。

2.2病毒核酸的提取

取200μL樣品浸出液或滅活病毒用于病毒RNA提取，操作方法按照Invitrogen公司的TRIzol reagent試劑說明書進行。用20μL DEPC H2O溶解提取的RNA，-20℃保存備用。取2μL用于多重RT-PCR反應。

2.3多重RT-PCR反應的建立

多重RT-PCR反應采用TaKaRa RT-PCR一步法試劑盒，反應體系根據其說明書進行配制，共25μL，其中2×Buffer 12.5μL，引物H1F和H1R各1μL，引物N1F和N1R各1μL，終濃度都為根據優化結果確定，混合酶1μL，RNA 2μL，DEPC H2O補足至25μL。反應條件為50℃逆轉錄30min，94℃預變性2min;然后94℃ 15s，55℃ 30s，72℃ 1min，35個循環;72℃延伸7min。反應結束后1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

2.4多重RT-PCR產物測序鑒定

PCR產物送往寶生物工程(大連)有限公司進行基因測序，將測序結果與在GenBank網站公布的新型甲型H1N1基因序列進行比對。

2.5多重RT-PCR反應條件的優化

2.5.1最佳多重RT-PCR上下游引物反應濃度的確定反應條件如2.3中進行，分別采用體系中上下游引物濃度均為0.2pmol/μL、0.4pmol/μL、0.6pmol/μL、0.8pmol/μL、1.0pmol/μL，25μL體系中其他因素不變進行RT-PCR反應，以確定最佳RT-PCR反應的上下游引物濃度。

2.5.2最佳多重RT-PCR反應退火溫度的確定利用2.5.1中得出最佳RT-PCR反應的上下游引物濃度，在其他條件相同的情況下采取不同的退火溫度進行RT-PCR反應，分別為53℃、54℃、55℃、56℃、57℃，檢測出最優的RT-PCR反應退火溫度以保證RT-PCR反應的特異性和產量。

2.6多重RT-PCR的特異性試驗

使用傳統的甲型H1N1以及H3N2、H5N1、H6N2和H9N2禽流感病毒RNA作為陰性對照，在相同的上述優化反應條件下進行多重RT-PCR反應，用來評價該方法的特異性。

2.7多重RT-PCR的敏感性試驗

將H1和N1陽性對照質粒在紫外分光光度計上測定OD260數值，換算成質量濃度，再根據分子量大小和阿佛加德羅常數換算成摩爾濃度，即拷貝數。然后將質粒原液10倍梯度稀釋成以下6個梯度濃度:106、105、104、103、102和10拷貝/μL。用建立的多重RT-PCR體系檢測，檢測到的重組載體的最少拷貝數即是該多重RT-PCR的靈敏度。

2.8臨床樣品檢測

對珠海各個口岸采集的183份發熱病人臨床咽拭子樣品和350份豬鼻腔拭子樣品采用本研究建立的多重RT-PCR進行檢測。同時，平行使用中國檢驗檢疫科學研究院研制的甲型H1N1流感病毒檢測試劑盒對以上陽性樣品進行檢測，檢測方法按照其試劑盒說明書進行。

3結果

3.1多重RT-PCR反應結果

分別以引物H1F、H1R和N1F、N1R建立單重RT-PCR反應，最后將引物合并于一管中建立多重RT-PCR反應。PCR產物瓊脂糖電泳后所得的特異性片段與預期的片段大小達成一致，分別為395bp和732bp(圖1)。

3.2多重RT-PCR條件的優化

3.2.1上下游引物濃度確定通過2.5.1中得出的瓊脂糖電泳結果(圖2)可以得知，最佳多重RT-PCR反應的上下游引物濃度是0.4pmol/μL。

3.2.2多重RT-PCR反應退火溫度的確定用不同的退火溫度進行多重RT-PCR反應，實驗表明55℃為多重RT-PCR反應最佳退火溫度(圖3)。

3.3多重RT-PCR反應的特異性試驗

采取本實驗建立起的多重RT-PCR反應體系，進行特異性試驗，只有陽性對照出現明顯的電泳帶，傳統的甲型H1N1以及H3N2、H5N1、H6N2和H9N2禽流感病毒的檢測結果均為陰性(圖4)。

3.4多重RT-PCR反應的敏感性試驗

通過進行對上述10個倍比梯度稀釋濃度的質粒模板檢測，從多重RT-PCR反應擴增產物電泳圖可以看出，該方法最低可以檢測到102拷貝/μL的模板(圖5)。

3.5臨床樣品檢測情況

實驗室一直承擔著檢測新型甲型H1N1流感病毒項目業務，先后對183份發熱病人臨床咽拭子樣品和350份豬鼻腔拭子樣品進行檢測，發現呈陽性的人咽拭子臨床樣品10份，豬鼻腔拭子樣品中沒有發現有陽性。陽性樣品結果與中國檢驗檢疫科學研究院試劑盒檢測結果一致。

4討論

2009年4月墨西哥暴發的流感疫情被確認為新型甲型H1N1流感之后，世界各地紛紛投入大量的人力物力資源進行新型甲型H1N1流感診斷檢測技術的研究，試圖進一步遏制住疫情的蔓延傳播，接著各種關于新型甲型H1N1流感病毒的檢測技術相繼出現。相對于傳統的病毒診斷檢測方法，一般是采用病毒分離法，該方法利用收集的動物咽肛拭子和疑似病料接種SPF雞胚或MDCK細胞，然后對培養物進行血凝反應等的血清學診斷，此診斷方法操作繁雜、實驗周期長、在采集樣品和培養病毒的過程中造成環境的污染，而且隨著病毒新的血清亞型、新的變異株不斷地出現，傳統的病毒分離法在實際應用中的局限性越來越明顯。

本實驗突破傳統病毒診斷檢測方法的局限性，表現快速、方便、流通量大等優點，從特異性實驗可以看出，本實驗建立起的多重RT-PCR體系只針對2009年出現流行的甲型H1N1流感毒株，并不能擴增之前公布的甲型H1N1流感病毒和其他流感病毒，具有高度的特異性。在敏感性檢查中，本實驗能檢測到低至核酸濃度達到102拷貝/μL的水平，檢測靈敏度高。所以本實驗非常適合新型甲型H1N1流感病毒的快速檢測工作。

參考文獻:

[1]HAMPSON A W. MACKENZIE J S. The influenze virus [J].Med J Aunt，2006，185(10):S39-43.

[2]PARIANI E，AMENDOLA A.ZAPPA，et al.Molecular characterization of influenza viruses circulating in Northern Italy during two seasons(2005/2006 and 2006/2007)of low influenza activity[J]. J Med Virol.2008，80(11):1984-1991

[3]SIDORENKO Y，REICHL U. Tructured model of influenza virus replication in MDCK cells[J]. Iotechnol Bioeng，2004，

88(1):1-14.

[4]BUTLE D. Swine flu goes global[J].Natuer，2009，458(7242):1082-1083.