分子生物學診斷技術的應用(二)

中圖分類號:S854.4+3文獻標識碼:B文章編號:1007-273X(2010)10-0004-04

3核酸擴增技術-聚合酶鏈反應(PCR)

核酸擴增包括聚合酶鏈反應、連接酶鏈反應和Qβ復制酶技術等，根據實際應用情況，主要介紹聚合酶鏈反應。

3.1PCR技術原理和過程

聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR)技術是在模板DNA、引物和4種脫氧單核苷酸存在的條件下，依賴于耐高溫的DNA聚合酶的酶促合成反應。PCR以欲擴增的DNA作為模板，以和模板正常和負鏈末端互補的兩種寡核苷酸作為引物，經過模板DNA變性、模板引物復性結合并在DNA聚合酶作用下發生引物鏈延伸反應來合成新的模板DNA。模板DNA變性、引物結合(退火)、引物延伸合成DNA構成一個PCR循環。每一循環的DNA產物經變性又成為下一個循環的模板DNA。這樣，目的DNA數量將以指數級別的形式擴增，在2h內可擴增30(n)個循環，DNA量可達原來的上百萬倍。PCR三步反應中，變性反應在高溫中進行，目的是通過加熱使DNA雙鏈解離形成單鏈;第二步反應又稱退火反應，在較低溫度中進行，它使引物與模板上互補的序列形成雜交鏈而結合上模板;第三步為延伸反應，是在4種dNTP底物Mg2+存在的條件下，由DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應。通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸3個溫度的循環，模板上介于兩個引物之間的片段不斷得到擴增。對擴增產物可通過凝膠電泳、Southern雜交或DNA序列分析進行檢測。

3.2PCR反應條件和反應系統的組成

反應條件:PCR反應通過3種溫度的交替循環來進行，一般94℃變性30s，55℃退火30s，70～72℃延伸30～60s，依此條件進行30次左右的循環。

PCR反應系統的組成:標準的PCR反應體系一般選用50～100μL體積，其中含有:50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl(室溫，pH值4.3)，1.6mmol/L MgCl2明膠或牛血清白蛋白(BSA)，2種引物，各0.25μmol/L，模板DNA 0.1μg;Taq DNA聚合酶2.5IU。

PCR基本操作。一個典型的PCR反應可按以下步驟進行:將下列成分依序加入0.5mL滅菌離心管中并混勻:滅菌雙蒸水30μL，10×擴增緩沖液10μL，4種dNTP混合物各16μL(每種濃度為1.25mmol/L)，引物1.5μL(100pmol)，引物2.5μL(100pmol)，模板DNA 2μL，加滅菌雙蒸水至終體積l00μL;置94℃加熱5min;將0.5μL Taq DNA聚合酶(5IU/μL)加入反應混合液中;將100μL輕礦物油加入混合液表面，以防水分蒸發。按所設定的反應條件進行循環反應(在PCR儀上進行);反應終止后，取樣品進行凝膠電泳，Southern雜交或DNA序列分析以鑒定是否得到特異的擴增產物。

3.3PCR衍生技術

PCR可擴增雙鏈DNA和單鏈DNA，并能以RNA為模板，進行反轉錄PCR(RT-PCR)以擴增cDNA。經不斷發展和完善，已有多種衍生PCR技術:除反轉錄PCR外，尚有不對稱PCR、反向PCR、錨定PCR、多重PCR、著色互補PCR、免疫PCR和套式PCR等。

反轉錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR):RT-PCR用于擴增RNA樣品。在PCR體系中先引入反轉錄酶，將RNA反轉錄獲得cDNA，再以cDNA作為PCR的模板，加入引物和Taq DNA聚合酶按正常PCR方式擴增cDNA。這一技術廣泛應用于RNA擴增和RNA病毒的檢測。

錨定PCR(Anchored PCR):通常進行的PCR試驗必須知道欲擴增DNA或RNA中段兩側的序列，并以此為依據設計引物進行PCR。當欲擴增的片段序列未知時，可通過錨定PCR進行擴增。其基本方法是分離細胞總RNA或mRNA并經反轉錄合成cDNA，通過DNA末端轉移酶在cDNA 3′端加上同源多聚物(polyd G)尾，通過與其互補的錨定引物(polyd C)來保證擴增反應的特異性。

反向PCR(Inverse PCR):常規PCR是擴增兩個已知序列之間的DNA片段，反向PCR則用于擴增位于已知序列的兩側的一段未知序列。方法是使含已知序列和未知序列的DNA片段環化，再用限制性內切酶切開已知序列，這樣線性化的原位于已知序列兩側的未知序列變為位于已知序列之間，再經常規PCR操作就可大量擴增未知序列。

不對稱PCR(Asymmetric PCR):不對稱PCR又稱單鏈擴增PCR。一般PCR反應中兩種引物的量是相等的，不對稱PCR中，兩種引物的量相差懸殊，一般為50～100∶1，這樣在生成一定數量的雙鏈產物后，較少的引物就會被用完，大量生成一條單鏈的DNA，分離單鏈即可直接進行序列分析等研究。

多重PCR(Multiplex PCR):應用PCR技術可檢測特定序列的存在或缺失。某些疾病的基因片段較大，且常有多處發生缺失或突變。用一對引物進行PCR檢測時，擴增不到目的片段，此時就須使用多重PCR技術。在同一反應管中加入多對引物，擴增同一模板的多個片段，如果某一片段缺失，或擴增該片段的引物與被檢核酸同源性太低，則在相應的電泳圖譜上就無相應的正常片段出現，但可保證其他特異片段出現。目前報道的多重PCR反應，最多可同時擴增12條區帶。當然，也可設計兩對引物，分兩次進行常規PCR。

著色互補PCR(Colour complementation assay):著色互補PCR又稱熒光PCR(F1uroscent PCR)。其原理是用不同的熒光染料分別標記不同的寡核苷酸引物，通過多重PCR同時擴增多個DNA片段。反應結束后除去多余引物，擴增產物在紫外線照射下能顯示某一種或幾種熒光染料顏色的組合，如果某一DNA區帶缺失，則會缺乏相應的顏色。通過顏色的有無及其組合可很快診斷基因的缺失、變異或發現某些感染的病毒基因等。這一技術為PCR技術的臨診自動化診斷打下了基礎。

免疫PCR:免疫PCR即免疫多聚酶鏈反應(Immuno-PCR)。它是將高度靈敏的PCR技術與特異的免疫學方法相結合的一種新型的診斷技術，是目前最有希望的診斷方法。它的原理是通過DNA和抗體具有雙重結合活性的連接分子使二者連接起來，這樣就可以使作為指示系統DNA分子通過抗體而特異性地結合到抗原上，從而形成一種特異性“抗原-抗體-DNA復合物”，再通過對其中已知片段DNA的PCR擴增，即可證明抗原存在與否。這種方法的特點在于:①通過免疫捕獲作用純化檢測對象;②用于檢測的微生物無需事先明確其核酸序列;③該方法也適用于微生物以外的抗原檢測，其前提條件是被檢測對象具有良好的抗原性，并且備有其相對應的抗體;④無需根據不同對象設計不同的引物。被連接的已知片段DNA相當于指示劑，無論檢測對象是什么，只需合成針對這段DNA的引物即可;⑤省去了普通PCR實驗檢測RNA病毒的反轉錄過程，既增加了靈敏度又降低了實驗成本。這項技術的發明者Sano，T.等的試驗表明，免疫PCR的靈敏度比ELISA方法高10萬倍，足以檢測出單個抗原分子。

套式PCR(Nested PCR):普通PCR的產物DNA往往需要再擴增，以便對之進行進一步鑒定、分子克隆或用作其他用途。此時，由于DNA產物的末端效應，用原來的那對引物難以實現再擴增的目的。如果在原來的引物內側重新設計一對引物，再進行新一輪PCR反應，這種采用多對成套引物，逐步擴增DNA內側片段的PCR就稱為套式PCR。目前很多分子生物學實驗室為了各自的研究需要都在應用這一技術。

3.4PCR技術用途

傳染病的早期診斷和不完整病原檢疫:在早期診斷和不完整病原檢疫方面，應用常規技術難于得到確切結果，甚至漏檢，而用PCR技術可使未形成病毒顆粒的DNA或RNA或樣品中病原體破壞后殘留的核酸分子迅速擴增而測定，且只需提取微量DNA分子就可以得出結果。

快速、準確、安全檢測病原體:用PCR技術不需經過分離培養和富集病原體。一個PCR反應一般只需幾十分鐘至2h就可完成，從樣品處理到產物檢測，1d之內可得出結果。由于PCR對檢測的核酸有擴增作用，理論上即使僅有一個分子的模板，也可進行特異性擴增，故特異性和靈敏度都很高，遠遠超過常規的檢測技術，包括核酸雜交技術。PCR可檢出fg水平的DNA，而雜交技術一般在pg水平。PCR技術適用于檢測慢性感染、隱性感染，對于難于培養的病毒的檢測尤其適用。由于PCR操作的每一步都不需活的病原體，不會造成病原體逃逸，在傳染病防疫意義上是安全的。

制備探針和標記探針:PCR可為核酸雜交提供探針和標記探針。方法是:①用PCR直接擴增某特異的核酸片段，經分離提取后用同位素或非同位素標記制得探針;②在反應液中加入標記的dNTP，經PCR將標記物摻入到新合成的DNA鏈中，從而制得放射性和非放射性標記探針。

在病原體分類和鑒別中的應用:用PCR技術可準確鑒別某些比較近似的病原體。如藍舌病毒與禽流感病毒。PCR結合其他核酸分析技術，在精確區分病毒不同型、不同株、不同分離物的相關性方面具有獨特的優勢，可從分子水平上區分不同的毒株并解釋它們之間的差異。如新近建立的禽流感RT-PCR分子診斷技術。

此外，PCR技術還廣泛應用于分子克隆、基因突變、核酸序列分析、腫瘤基因和抗癌基因以及抗病毒藥物等研究中。

3.4PCR技術應用概況

從誕生至今約20年的時間里，PCR技術已在生物研究領域得到廣泛的應用，將PCR技術用于動物傳染病的檢疫診斷研究也日趨廣泛。例如，新西蘭農漁部質量管理機構所屬動物健康實驗室(AHL)負責對各種外來疾病的疫情監測診斷，該室在1992年建立了幾項PCR檢測技術，包括從結核病病灶中快速檢測牛分枝桿菌;快速檢測患病牛羊中副結核分枝桿菌;檢測惡性卡他熱和新城疫等。

自1990年始，將PCR應用于動物傳染病的診斷等研究的報道，可歸納如下。

快速診斷各類病毒病。用PCR成功進行檢測的動物傳染病病毒有:藍舌病病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛白血病病毒、馬鼻肺炎病毒、惡性卡他熱病毒、偽狂犬病病毒、狂犬病病毒;非洲豬瘟病毒、禽流感病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、禽傳染性喉氣管炎病毒、馬傳染性肺炎病毒、馬立克氏病毒、牛冠狀病毒、魚傳染性造血器官壞死病病毒、輪狀病毒、魚病病毒、水貂阿留申病病毒、山羊關節-腦炎病毒、梅迪-維斯納病毒、豬細小病毒等。

由其他病原體引起的傳染性疾病的研究。目前已報道的有致病性大腸桿菌毒素基因、牛分枝桿菌、炭疽桿菌芽孢、鉤端螺旋體、牛巴斯蟲和弓形蟲等的PCR檢測研究。在儀器微生物的檢測中，PCR技術的應用也日益廣泛。Homes等采用一種固相比色PCR技術成功檢測了大腸桿菌熱穩定腸毒素(STs)、IS(STIa)和Ib(STLb)基因。

4核酸電泳技術

核酸電泳包括聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和瓊脂糖凝膠電泳等，簡介如下。

4.1聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

帶電荷的物質在電場中的趨向運動稱為電泳。核酸電泳是進行核酸研究的重要手段，是核酸探針、核酸擴增和序列分析技術等不可或缺的組成部分。核酸電泳通常在瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠中進行，濃度不同的瓊脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子篩網孔大小不同的凝膠，可用于分離不同分子量的核酸片段。

凝膠電泳操作簡便、快速，可以分辨用其他方法(如密度梯度離心)所無法分離的核酸片段，是分離、鑒定和純化核酸的一種常用方法。聚丙烯酰胺凝膠通過丙烯酰胺單體、鏈聚合催化劑N，N，N，N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)和過硫酸銨以及交聯劑N，N'-亞甲雙丙烯酰胺之間的催化反應而形成。丙烯酰受單體在催化劑作用下次生聚合反應形成長鏈，長鏈經交聯劑作用交叉連接形成凝膠，其孔徑由鏈長和交聯度決定。鏈長取決于丙烯酰胺的濃度，調節丙烯酰胺和交聯劑的濃度比例，可改變聚合物的交聯度。聚丙烯酰胺凝膠電泳根據電泳樣品的電荷、分子大小及形狀的差別達到分離目的，兼具分子篩和靜電效應，分辨率高于瓊脂糖凝膠電泳。可分離只相差1個核苷酸的DNA片段。聚丙烯酰胺凝膠電泳用于分析和制備長度小于1kb的DNA片段，根據所要分離的核酸片段大小，可制備不同濃度的凝膠。

凝膠的制備和電泳:由于氧能抑制丙烯酰胺的聚合反應，灌制聚丙烯酰胺凝膠常在兩塊封閉的玻璃平板所形成的夾層間進行。在這種裝置形式下，僅有頂層的凝膠與空氣中的氧氣相接觸，從而大大減少了氧對聚合的抑制作用。聚丙烯酰胺凝膠電泳一般采用垂直裝置。

4.1.1材料與方法試劑配制:①30%丙烯酰胺:100mL雙蒸水中含29g丙烯酰胺和1g N，N'-亞甲雙丙烯酰胺。②5×TBE:每升溶液含5.4g Tris-HCl，2.75g硼酸和20mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。③10%過硫酸銨:10mL雙蒸水中含1g過硫酸銨。

凝膠的制備和電泳操作:將玻璃和墊條事先用去污劑刷洗，并經自來水和無離子水沖洗干凈，晾干。裝置時，將較大的玻璃板平放在工作臺上，將兩個墊條放在玻璃板兩側，涂上少量凡士林，并將上層玻璃板置于墊條上，用夾子將玻板連同墊條夾緊，底部用1%瓊脂糖密封。為防止漏膠，除放梳子一邊外，其余三邊用防水膠帶密封。根據玻璃板大小及夾層厚薄計算所需凝膠溶液量，計算配制溶液(100mL)。將35μL LTEMED加入100mL混合液中，混勻，然后均勻連續注入兩玻璃板空隙中，立即插入電泳梳，勿使梳齒下形成氣泡;室溫聚合1h，梳齒下出現折光帶時，表明聚合反應已經完成。若凝膠不立即使用，可用紗布或濾紙(用l×TBE浸泡)包蓋于凝膠頂部，置4℃保存1～2d;拔掉梳子，立即用水沖洗加樣孔;除去底部膠帶，將疑膠直立放入電泳槽。在上下兩槽中灌好1×TBE溶液，驅盡凝膠底部附著的氣泡。并用1×TBE溶液沖洗加樣孔;將核酸樣品與6×凝膠加樣緩沖液混合，并加入凝膠加樣孔中;接通電源，正極與下槽連接。電壓一般控制在1.8V/cm。電壓過高時凝膠產生的熱量可造成DNA區帶彎曲，甚至引起小DNA片段的解鏈;電泳畢，取下玻板和凝膠，放在工作臺上，從夾層一角輕撬，將上面的玻板輕輕移開，并小心揭下凝膠，置染色液中染色并進行結果觀察。

4.1.2凝膠的染色和觀察聚丙烯酰胺凝膠中核酸帶的染色，常用溴化乙錠法和銀染法。前者與瓊脂糖凝膠的染色方法相同。銀染法的靈敏度較高，可如下操作:將凝膠置固定液(10%乙醇、0.5%冰醋酸)中固定10min;雙蒸水洗1～2次;置0.01mol/L AgNO3溶液中，室溫反應15～30min;充分水洗;置NaOH-甲醛混合液(200mL 3%NaOH，含1mL甲醛)中反應至條帶顯色清晰，本底適宜;用5%冰醋酸終止反應。

4.2瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物。將瓊脂糖在所需緩沖液中加熱熔化成清澈、透明的溶膠，然后倒入膠模中，凝固后將形成一種固體基質，其密度取決于瓊脂糖的濃度;將凝膠置電場中，在中性pH值下帶電荷的核酸通過凝膠網孔向陽極遷移，遷移速率受到核酸的分子大小、構象、瓊脂糖濃度、所加電壓、電場、電泳緩沖液、嵌入染料的量等因素影響。在不同條件下電泳適當時間后，大小、構象不同的核酸片段將處在凝膠不同位置上，從而達到分離的目的。瓊脂糖凝膠的分離范圍較廣，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可分離長度為200bp至50kb的DNA。

4.2.1材料儀器設備應包括水平凝膠電泳槽及其配套電泳梳、穩壓電泳儀、微波爐或普通電爐。同時配備紫外線檢測儀和照相系統。試劑包括瓊脂糖、電泳緩沖液、溴化乙錠溶液、凝膠加樣緩沖液。

電泳緩沖液常用TBE(1 000mL中含5.4gTris，2.75g硼酸，2mL 0.5mol/L EDTA，pH8.0)。

溴化乙錠(ethidium bromide，EBO)是一種熒光染料，它可以嵌入核本雙鏈的配對堿基之間，在電泳過程中隨核酸片段遷移，將凝膠置紫外光下，插入核酸鏈中的EB在紫外線激發下產生紅色熒光，可清楚顯示各核酸片段的遷移。EB見光易分解，應存棕色試劑瓶中于4℃下保存。由于EB是一種強的誘變劑并有中度毒性，使用時必須戴手套操作。

4.2.2操作方法用透明膠將玻璃板或電泳裝置所配備的膠板的邊緣圈封，制成膠模，置水平工作臺上;稱取適量瓊脂糖，置電泳緩沖液中，加熱使瓊脂糖溶解;待溶液冷至60℃，加入10mg/mL EB貯存液濃度達0.5mg/mL;在距離膠模底板0.5～1.0mm處放置電泳梳，將瓊脂糖溶液倒入膠模中，厚度為3～5mm，注意避免產生氣泡;凝膠完全凝固后，移去梳子和透明膠，將凝膠放入電泳槽。加入TBE緩沖液使恰好過膠面約lmm;將DNA樣品與1/6體積加樣緩沖液混合后，加入樣品槽中;接通電源，使樣品槽在負極端，用1～5V/cm的電壓，電泳適當時間;電泳結束后，可將含EB的凝膠直接放在紫外線檢測儀上觀察，并拍照記錄，也可將不含EB的凝膠在0.5μg/mL的EB溶液中染色30～45min，再如上觀察和拍照，記錄結果。

凝膠攝影:可使用凝膠自動處理系統進行。

4.2.3注意事項EB溶液的凈化處理:由于EB具有一定的毒性，實驗結束后，應對含EB的溶液進行凈化處理再行棄置，以避免污染環境和危害人體健康。對于EB含量大于0.5μg/mL的溶液，可如下處理:將EB溶液用水稀釋至濃度低于0.5μg/mL;加入一倍體積的0.5mol/L K2MnO4，混勻，再加入等量的25mol/L HCl，混勻，置室溫數小時;加入一倍體積的25mol/L NaOH，混勻并廢棄。EB含量小于0.5μg/mL的溶液可如下處理:按1mg/mL的量加入活性炭，不時輕搖混勻，室溫放置1h;用濾紙過濾并將活性炭與濾紙密封后丟棄。