白地霉和解淀粉芽孢桿菌對黃瓜枯萎病的防治效果

摘要：采用生物測定法，初步研究了解淀粉芽孢桿菌SYX-1和白地霉SYX-2對黃瓜枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌的拮抗作用。結(jié)果表明：兩種生防菌在菌懸液濃度為10⁵～10^７cfu／ml時(shí)黃瓜種子胚根的伸長拮抗率分別為71.3％和81.2％，而混合菌株菌懸液的胚根伸長拮抗率高達(dá)85.3％；盆栽試驗(yàn)表明，SYX-1和SYX-2生防菌菌懸液對黃瓜枯萎病的防效分別為43.3％和46.4％，其混合菌株菌懸液的防效達(dá)52.8％，兩種生防菌對植株生長均有明顯的促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：白地霉；解淀粉芽孢桿菌；黃瓜枯萎病；生防菌

中圖分類號：S436.421.13 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001—4942(2010)12—0055—03

隨著種植結(jié)構(gòu)調(diào)整，日光溫室和大棚面積不斷增加，設(shè)施環(huán)境給蔬菜真菌病害的發(fā)生發(fā)展提供了合適的條件，致使其發(fā)生種類、數(shù)量及危害程度逐年增加，嚴(yán)重影響蔬菜的產(chǎn)量和質(zhì)量。黃瓜枯萎病是一種危害嚴(yán)重的土傳真菌病害，長期以來對其防治主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥，而化學(xué)農(nóng)藥的殘留對人畜健康的影響及其對生態(tài)環(huán)境的威脅日益受到社會(huì)的普遍關(guān)注，因此生物防治以其無污染、無殘留、持效期長、環(huán)境兼容性好的特點(diǎn)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)特別是蔬菜、瓜果類和一些經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的作物生產(chǎn)中愈來愈顯得重要。本文對本實(shí)驗(yàn)室篩選鑒定得到的一株白地霉(Geotrichum can-didum)和一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliq-uefaciens)菌株進(jìn)行了室內(nèi)生物測定和溫室盆栽防治試驗(yàn)，旨在為進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2010年在煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試生防菌為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)SYX-1和白地霉(Geotrichum candidum)SYX-2；供試病原真菌為黃瓜尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)；供試蔬菜為黃瓜品種克瑞特(煙臺市農(nóng)科院蔬菜研究所)。

1.2 菌液及主要培養(yǎng)基的制備

1.2.1 SYX-1和SYX-2菌體發(fā)酵 經(jīng)固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)活化的兩株生防菌接種到150ml PDA液體培養(yǎng)基中，配方見《菌種保藏手冊》，28℃恒溫旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)4d(100r／min)，無菌水稀釋調(diào)整懸液濃度為10²～10⁷cfu／ml。混合菌懸液即將分別制好的兩種菌懸液按體積比1：1混合，備用。

1.2.2 麥粒砂擴(kuò)大培養(yǎng)基 培養(yǎng)基成分為：麥粒1份，砂1份。麥粒煮開，泡軟但不開裂，加入等量的砂子，混勻，加適量水，分裝后濕熱滅菌0.5h，隔一天再滅菌0.5h。將病原菌接種到麥粒砂培養(yǎng)基上，恒溫箱內(nèi)28℃培養(yǎng)，菌絲長滿后取出風(fēng)干，磨碎，過篩備用。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 平板菌落的抑菌活性檢測 采用平板對峙法，在PDA平板一側(cè)接種經(jīng)活化培養(yǎng)的尖孢鐮刀菌，另一側(cè)對稱位置接種生防菌SYX-1或SYX-2，28℃恒溫培養(yǎng)3d，每處理重復(fù)3皿，觀察拮抗反應(yīng)。

1.3.2 胚根抑制試驗(yàn) 刮取PDA上培養(yǎng)了7d的尖孢鐮刀菌菌絲體于無菌水中，制成孢子懸液，經(jīng)滅菌紗布過濾，濾液調(diào)至10⁵～10⁶efu／ml。黃瓜種子在50～55℃水中浸泡1～2min，然后在30％水中浸泡2h，用濕潤的紗布包好，放于28℃培養(yǎng)箱中催芽。將“露白”的種子在尖孢鐮刀菌菌液中浸泡10min后均勻排置于滅菌濾紙上，每皿放10粒種子。再向種子上分別滴加已配制的SYX-1菌懸液(處理A)、SYX-2菌懸液(處理B)和混合菌懸液(處理C)，滴加無菌水為CK1，種子未經(jīng)病原菌浸泡、滴加無菌水的為CK2，28℃培養(yǎng)32h，重復(fù)3次，計(jì)算胚根伸長抑制率。

1.3.3 盆栽試驗(yàn) 將在麥粒砂培養(yǎng)基上擴(kuò)繁的黃瓜尖孢鐮刀菌按盆土重量12％的比例加入到滅菌沙壤土中，混勻裝盆、澆透備用；黃瓜種子用

1.3.2 中的催芽方法催芽備用。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：CK(無生防菌處理)、SYX-1(黃瓜種子在生防菌SYX-1孢懸液中浸泡30min)、SYX-2(黃瓜種子在生防菌SYX-2孢懸液中浸泡30min)、SYX-1+SYX-2(黃瓜種子在生防菌SYX-1和SYX-2混合孢懸液中浸泡30min)，每處理4盆，每盆10株。黃瓜出苗后常規(guī)管理，不施肥和農(nóng)藥。黃瓜出苗生長4周后，測量植株株高、鮮重和干重，調(diào)查黃瓜枯萎病病情指數(shù)。病害分級標(biāo)準(zhǔn)、病情指數(shù)及防效統(tǒng)計(jì)采用方中達(dá)的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 活體菌落的平板抑菌作用

由平板對峙培養(yǎng)的結(jié)果可見，生防菌SYX-1和SYX-2在與病原菌同時(shí)接種4d后均產(chǎn)生明顯的抑菌帶，且抑菌帶寬度不隨時(shí)間推移而顯著改變。其中SYX-1對尖孢鐮刀菌的抑菌帶寬度為2.5mm，SYX-2的抑菌帶寬度為2.8mm，且后者抑菌帶邊緣病原菌菌絲體呈現(xiàn)明顯老化現(xiàn)象。

2.2 胚根生長測定

如圖2所示，處理B和C的黃瓜種子與CK2的種子胚根生長情況基本一樣，處理A的胚根生長稍微受到了抑制，但相對于CKl來說胚根生長狀況良好。由此說明，菌株SYX-2具有很強(qiáng)的拮抗效果，而兩種菌株混合對于病原菌的抑制效果更好。

由表1知，經(jīng)菌株SYX-1、SYX-2及兩種菌株混合孢懸液浸泡的黃瓜種子胚根伸長拮抗率分別為71.3％、81.2％、85.3％，幾乎能夠抑制病原菌對黃瓜種子的傷害，使黃瓜種子的胚根正常生長。

2.3 SYX-1和SYX-2對黃瓜幼苗生長的影響和防治黃瓜枯萎病的效果

菌株SYX-1和SYX-2對黃瓜幼苗生長影響的測定結(jié)果(表2)表明，SYX-1和SYX-2不同處理的黃瓜幼苗株高、鮮重和干重均顯著高于對照。其中經(jīng)混合菌株浸泡的黃瓜幼苗干重比對照高129％，稍高于單獨(dú)菌種的處理。由此可見，兩株生防菌不僅對黃瓜幼苗均有促生作用，而且兩菌株間存在協(xié)同作用。

SYX-1和SYX-2處理對黃瓜枯萎病具有較好的防治效果(表3)。對照發(fā)病率為100％，而經(jīng)過SYX-1、SYX-2和二者共同處理的發(fā)病率只有40.5％、38.8％和35.8％，防效分別是43.3％、46.4％和52.8％。由此可見，混合菌株處理防治效果最好，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論與討論

白地霉是一種形態(tài)類似小型絲狀真菌的酵母菌，作為一種極具潛力的菌種，其菌體蛋白質(zhì)價(jià)值很高，在脂肪酶、天然香氣化合物的合成、奶酪行業(yè)、白酒生產(chǎn)、環(huán)境治理、飼料蛋白等方面有巨大的開發(fā)價(jià)值，但是對于白地霉的生防菌作用效果還未見報(bào)道。解淀粉芽孢桿菌在自然界中廣泛存在，能夠?qū)Χ喾N真菌與細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用，具有豐富的自身代謝產(chǎn)物，通過分泌抗生物質(zhì)和生長競爭，在防治植物病害方面發(fā)揮多種有益作用，這些抗菌物質(zhì)主要有低分子量的抗生素如肽類、脂肽類、細(xì)菌素以及高分子量蛋白類抗菌物質(zhì)等。

白地霉和解淀粉芽孢桿菌作為兩種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的拮抗菌，其作用機(jī)理可能不盡相同，但在防治效果上有可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。過去雖然也有用混合菌進(jìn)行病害防治的研究，但很少分析各菌單獨(dú)使用和混合使用的效果。本試驗(yàn)用單一菌和其混合菌對黃瓜枯萎病進(jìn)行了室內(nèi)防治試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩種菌對黃瓜枯萎病都有防治效果，并且用混合菌處理的防治效果好于單一菌，顯示兩菌株的防病作用具有一定的協(xié)同效應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果還表明，這兩種生防菌對促進(jìn)黃瓜生長方面具有明顯效果。因此對植物病害防治應(yīng)該考慮利用作用機(jī)制不同的生防菌，設(shè)計(jì)出多靶位制劑策略，從而減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，在無公害蔬菜生產(chǎn)和改善生態(tài)環(huán)境方面發(fā)揮巨大作用。