重組凝乳酶原在大腸桿菌中的表達及活性研究

李新蘋，劉歡歡，普燕，張富春，李軼杰

（新疆大學 生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046）

重組凝乳酶原在大腸桿菌中的表達及活性研究

李新蘋，劉歡歡，普燕，張富春，李軼杰

（新疆大學 生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046）

為了提高干酪生產中起重要凝乳作用的凝乳酶的原核表達效率，分析了Genbank中牛、羊和駱駝凝乳酶原（prochymosin，pCHY）的保守序列及大腸桿菌密碼子的偏愛性，合成了凝乳酶原序列，并將其克隆至大腸桿菌原核表達載體上。經IPTG的誘導得到高效表達的凝乳酶原；Western blotting檢測證明了其具有免疫原性；經pH值2到6活化后成功自剪切，得到大小約36 ku的有凝乳活性的凝乳酶。研究獲得較高表達水平具有凝乳活性的重組凝乳酶。

凝乳酶原；密碼子優化；凝乳活性

0 引 言

凝乳酶以凝乳酶原（prochymosin，pCHY）的形式分泌，在酸性條件下自剪切成有活性的凝乳酶[1]，其傳統來源是乳牛的皺胃，不但適于制造各種類型的干酪，還是衡量其它凝乳酶代用品的標準。我國凝乳酶生產還沒產業化[2]，其性質及代用品的研究對我國干酪產業的發展有重要的意義。基因工程菌可高效表達凝乳酶，國內外許多學者應用多種表達系統對其進行了研究，如曲霉[3]， 畢赤酵母[4，5]，乳酸克魯維酵母[6]，乳酸乳球菌[7]，大腸桿菌[8，9]等。基因工程菌用于工業化生產其首要前提是凝乳酶原基因有較高的表達效率，所以本研究根據牛、羊和駱駝的凝乳酶原保守序列及大腸桿菌密碼子的偏愛性合成了凝乳酶原基因，實現了其在大腸桿菌的高效表達，為凝乳酶的工業化生產奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌株

質粒pGEX-4T-1，菌種E.coli DH5α和E.coli BL21（DE3）。

1.1.2 試劑和儀器

限制性內切酶，T4連接酶，DNA聚合酶，質粒提取試劑盒，膠回收試劑盒，羊抗兔IgG-HRP抗體，天然凝乳酶，其余均為分析純試劑。

1.2 大腸桿菌表達載體的構建與鑒定

根據http：//www.kazusa.or.in/codon對E.coli編碼氨基酸的密碼子使用頻率的分析，綜合幾種凝乳酶原基因，對其進行密碼子優化后，送至上海生工公司合成相應的基因序列。將PCR擴增并回收的pCHY基因用EcoR I和Xho I雙酶切后，回收酶切產物連到同樣酶切回收的pGEX-4T-1載體上，轉化E.coli DH5α篩選重組質粒的轉化子并提取重組質粒，再進行PCR及酶切鑒定。選擇酶切正確且PCR鑒定為陽性的重組質粒送上海生工公司進行序列測定。測序正確的重組質粒用于構建E.coli BL21（DE3）pGEX-4T-1-pchy工程菌。

1.3 重組凝乳酶原基因在E.coli BL21（DE3）中的誘導表達

挑取pCHY+的單個菌落，接種于新鮮LB培養基（含Amp+50 mg/L）中，37℃培養過夜。次日，按1%的接菌量接至新鮮LB培養基（含Amp+50 mg/L）中。當0D600達到0.6～0.8時，在其中加入濃度為0.08 mmol/L的IPTG，在37℃下進行誘導表達。收集誘導后E.coli BL21（DE3）的菌體，PBS洗滌后進行全細胞蛋白SDSPAGE電泳，觀察蛋白表達情況。

1.4 pCHY蛋白的提取[10]

將得到的菌體沉淀洗滌后，用濃度為8 mol/L的尿素[11]溶解，復性后，加入GSH/GSSG透析。

1.5 重組牛凝乳酶原的Western blotting[12]

將表達的融合蛋白GST-pCHY經SDS-PAGE分離后，電轉至硝酸纖維素膜上，以3%BSA封閉過夜，依次與核酸疫苗制備的兔抗pCHY抗血清、山羊抗兔IgG-HRP分別室溫反應1 h，PBST洗滌3次后，加入DAB顯色并拍照。

1.6 重組牛凝乳酶原的活化和凝乳活性

將GST-pCHY蛋白溶液的pH用2mM HCl調整至2.0，室溫下放置2 h，然后用1M Tris緩沖液（pH8.0）將蛋白溶液的pH回調至6.0，SDS-PAGE分析凝乳酶原的活化情況。

按照孫大慶等[7]的方法，在一個96孔板中，每孔100 μL的檢測混合液包括10%的脫脂乳粉、Ca2+、pH值為6.0的磷酸鹽緩沖液和活化后的凝乳酶，35℃ 孵育30 min。96孔板倒置于吸水紙上，除去未凝固的上清。與天然凝乳酶比較，計算重組凝乳酶的凝乳活性[13]。

2 結 果

2.1 表達載體pGEX-4T-1-pchy的鑒定

表達載體pGEX-4T-1-pchy經EcoRI和Xho I酶切和PCR鑒定（如圖1），均得到約1.1 kb的片段，與理論值大小相符。取鑒定陽性的克隆進行了測序，測序結果與合成的對應序列完全一致，表明表達載體pGEX-4T-1-pchy構建成功。

2.2 重組菌株的誘導表達

將構建成功的E.coli BL21（DE3）/pGEX-4T-1-pchy的轉化子在新鮮LB培養基中培養，經IPTG誘導收集轉化菌，如圖2所示。離心后取上清和沉淀分別留樣。菌體沉淀用PBS洗滌，并用細胞裂解液處理后進行超聲，直至菌體不再粘稠，離心后分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE。 結果表明，在E.coli BL21（DE3）中構建的工程菌表達了帶有GST標簽的約67 ku大小的外源蛋白，與理論大小一致，且以包涵體的形式存在，表達量較高，初步表明對pCHY基因密碼子的優化是成功的。

2.3 重組牛凝乳酶原的Westernblotting檢測

對包涵體溶解并透析后的GST-pCHY蛋白進行Western blotting檢測（如圖3所示），在67 ku處出現了一條比較特異的條帶，表明GST-pCHY包涵體蛋白經變性復性后具有免疫原性，即初步表明GST-pCHY蛋白復性后恢復了其免疫活性。

2.4 重組牛凝乳酶原活化和凝乳活性分析

將GST-pCHY蛋白溶液酸化后恢復其pH值至6.0，分別取pH恢復前和恢復后留樣，進行SDS-PAGE電泳檢測。由圖4可以看出，與復性后的蛋白相比，經酸化處理后，67 ku處的條帶消失，在約36 ku處出現了特征性條帶，初步表明對凝乳酶原的活化成功。

將凝乳酶原活化后，選擇測定凝乳活力的脫脂乳最佳濃度[14]，加入96孔板中，進行凝乳活性檢測，結果如圖5所示。由圖5可以看出，質量濃度為10 g/L的天然凝乳酶的凝乳活力為133.3個Soxhlet單位（SU），重組凝乳酶可達26.7個SU，相當于每mL含有2 mg天然凝乳酶。

3 討 論

大腸桿菌作為宿主，表達的包涵體蛋白產量高，易于分離，可用于工業化生產。E.coli對編碼同一種氨基酸的各種密碼子的使用具有偏愛性，使用其常用的密碼子，可以提高重組蛋白的表達水平[15]。袁偉，馮鎮[16，17]等采用了乳酸克魯維酵母中高度或中度使用頻率的密碼子對牛凝乳酶原基因進行了密碼子優化，使難以在乳酸克魯維酵母中高效表達的基因得到表達。MENZELLA H.G.[18]表明，對大腸桿菌中基因序列進行密碼子優化時，密碼子隨機選擇比一個氨基酸對應一個密碼子表達的凝乳酶的產量高。本研究利用該系統，優化了凝乳酶原基因的密碼子，表達了具有生物活性的凝乳酶原，活化后凝乳效果顯著。

本研究不但分析了大腸桿菌中密碼子的使用頻率，同時還綜合了牛、羊、駱駝這些主要動物來源的凝乳酶原的基因序列，以期在干酪生產中產生更好的凝乳效果及風味。牛凝乳酶具有較高的凝乳活性和較低的蛋白水解活性，是優先選用的凝乳酶。但牛凝乳酶不能使生駝乳凝固，研究表明駱駝凝乳酶的凝乳活性比牛凝乳酶高70%，非特異性的蛋白水解活力只相當于牛凝乳酶的20%，耐熱性更好[19]。而山羊凝乳酶比牛凝乳酶更耐熱且更穩定[20]，已有研究者完成了對其的克隆[21]，重組羔羊凝乳酶制造的奶酪與重組牛凝乳酶有相似品質[22]。對本研究得到的凝乳酶進行凝乳實驗后發現，它可以使生駝乳凝固。

凝乳酶原除了可用于制作干酪外，有研究者也關注于凝乳酶原的自剪切作用，將其與標簽蛋白基因構建在一起，通過自剪切作用切除標簽蛋白，得到單純的靶蛋白，拓展了凝乳酶原的應用范圍[23]。本文利用凝乳酶原的這一優勢來切割標簽蛋白，得到有活性的凝乳酶，從而簡化蛋白純化的程序。同時，在純化凝乳酶方面我們也通過超濾等技術進一步的探索，以期得到純度高的凝乳酶。

本研究在大腸桿菌系統中通過優化密碼子，得到了高效表達的凝乳酶原，可以為我國大規模生產凝乳酶提供優良的菌株，使我國擁有自主產權的凝乳酶，從而擺脫依賴進口的現狀，具有良好的應用前景。

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Expression of recombinant prochymosin in E.coli and research on its activity

LI Xin-ping,LIU Huan-huan,PU Yan,ZHANG Fu-chun,LI Yi-jie
（College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China）

Chymosin plays an important role in clotting milk when manufacturing cheese.Aim to improve the expression of recombinant chymosin,we analyzed the conserve sequence of buffalo,lamb,camel in Genbank and the optimal codons of E.coli,synthesized the sequence of prochymosin.The gene encoding prochymosin has been cloned and hyperexpressed in E.coli BL21（DE3）after IPTG induction.Western blotting indicates the prochymosin protein has antigenicity.SDS-PAGE shows it could autocatalytically clip at acidic pH,and activited chymosin which is about 36 ku shows milk clotting activity.The recombinant chymosin which could make milk clotting has high level expression.

prochymosin;optimal codons;clotting milk

Q789，Q936

A

1001-2230（2011）09-0014-03

2011-07-01

國家自然科學基金資助（30860265）;新疆生物資源基因工程重點實驗室基金（XJDX0201-2010-2）。

李新蘋（1986-），女，碩士，研究方向為生化與分子生物學。

李軼杰