擴增cca R基因提高棒狀鏈霉菌克拉維酸產量的研究

左志晗，鄭津輝

（天津師范大學a.生命科學學院，b.天津市細胞遺傳與分子調控重點實驗室，天津 300387）

擴增ccaR基因提高棒狀鏈霉菌克拉維酸產量的研究

左志晗，鄭津輝

（天津師范大學a.生命科學學院，b.天津市細胞遺傳與分子調控重點實驗室，天津 300387）

在棒狀鏈霉菌B71－14中擴增對克拉維酸具有正調控作用的基因ccaR，構建了ccaR的重組質粒pSET152－ccaR，通過接合轉移將重組質粒pSET152－ccaR轉入了S.clavuligerusB71－14中，通過pSET152－ccaR中的att P位點整個質粒插入到S.clavuligerusB71－14基因組中的attB位點，實現了S.clavuligerusB71－14基因組DNA中增加一個拷貝ccaR基因的目的，所得突變株S.clavuligerus：：ccaR產酸量可達820.91 mg／L，較出發菌株提高了54%.

克拉維酸；棒狀鏈霉菌；ccaR［Q812］

克拉維酸是棒狀鏈霉菌的代謝產物，又名棒酸，結構式如下.

其本身抗菌活性很弱，但具有強力、廣譜且不可逆的β－內酰胺酶抑制活性.大量體外抗菌作用研究表明，β－內酰胺酶抑制劑與β－內酰胺類抗生素聯合應用可增強后者的抗菌活性.

由于抗生素的大量使用，導致很多細菌產生了抗藥性，這己成為臨床上治療細菌性疾病的一個越來越棘手的問題.克拉維酸同β－內酰胺類抗生素聯合使用既抑制了β－內酰胺酶的活性，又增強了這類抗生素的廣譜抗菌作用，可有效解決產酶細菌的耐藥性問題.但當前我國臨床上使用的復方β－內酰胺類抗生素來源主要依賴進口產品，其主要原因是菌株的產酸能力差，因此如何獲取高產菌株是解決這種現狀的關鍵.隨著鏈霉菌分子生物學技術的發展，以及克拉維酸代謝途徑和相應基因簇的進一步揭示，通過基因工程的手段來獲取高產菌株已成為可能［1］.

目前，克拉維酸生物合成途徑的基因簇己經被闡釋.克拉維酸合成具有獨立的代謝途徑，它以D－3－磷酸甘油醛和精氨酸為前體物質［2］，依次在ceaS，bls，pah，cas和oat等基因編碼酶的作用下合成，Kapil等［3］研究還發現參與克拉維酸生物合成的上述基因均具有與之相似的同源基因，且相互同源的基因分別集中在兩套平行的基因簇內：一套包括ceaS1，bls1，pah1 和oat1 等 基 因；另 一 套 包 括ceaS2，bls2，pah2，cas2和oat2等基因，且兩套基因簇中的基因排列順序非常相似.

除上述基因外，在棒狀鏈霉菌中，抗生素及克拉維酸的合成受到按級別排列的一系列基因的調控，故某些調控基因的變化可能會使克拉維酸產量獲得提高［4］.

ccaR是棒狀鏈霉菌克拉維酸生物合成的調節基因之一，位于棒狀鏈霉菌頭霉素C基因簇lat基因下游4 kb處，編碼由256個氨基酸組成的類ActII－ORF－4調控蛋白.ccaR的作用是結合于cefD－cmcl基因之間的雙向啟動子上，對于頭霉素C和克拉維酸生成途徑的中、下游所需要酶的轉錄過程起到調節作用.它還可以結合在自身的啟動子上，是一個正調節因子.ccaR的突變將導致頭霉素C和克拉維酸或其它棒烷類合成的停止；當回補ccaR基因后，頭霉素C和克拉維酸的合成得以恢復；盡管頭霉素C和克拉維酸這兩個β－內酰胺類物質的合成途徑截然不同，但當增加ccaR拷貝數后，頭霉素C和克拉維酸的產量都將成倍增加［5］.

本研究選取棒狀鏈霉菌的ccaR為目標基因，構建了含ccaR基因的重組質粒pSET152－ccaR，對棒狀鏈霉菌的ccaR基因進行了擴增，并對所得的突變菌株的克拉維酸產量變化進行了研究.

1 實驗材料與方法

1.1 質粒、菌株及培養基

棒狀鏈霉菌S.clavuligerusB71－14（紫外誘變獲得的克拉維酸高產菌株），用于接合轉移的E.coliET12567／p UZ8002以及E.coliDH5α均為本實驗室保存菌種.

PCR產物克隆載體 p UCm－T（AmpR），購自Sangon公司；大腸桿菌 －放線菌穿梭質粒載體pSET152，含有接合轉移起始位點（RK2ori T）、阿泊拉霉素抗性基因（aacC4）和特異整合位點att P，由加拿大阿爾伯塔大學Annie教授惠贈.

E.coliET12567／p UZ8002 以 及E.coliDH5α所用為LB培養基［6］；棒狀鏈霉菌所用產孢培養基為YMGA培養基［7］，種子培養采用TSB培養基，發酵培養采用SS培養基［8］.大腸桿菌－鏈霉菌接合培養基采用改良 AS－1培養基（g／L）［9］，即在每升AS－1培養基中添加5 g蛋白胨及0.5 g葡萄糖.

以上所用培養基中，在培養帶有質粒的抗性菌株時培養基中抗生素的使用濃度如下：氨芐青霉素終質量濃度為100μg／m L，阿泊拉霉素為25μg／m L，卡那霉素為50μg／m L，氯霉素為25μg／m L，萘啶酮酸為25μg／m L.

1.2 DNA體外重組

大腸桿菌中質粒DNA的提取、限制性內切酶消化、連接、PCR以及轉化等操作均按Sambrook等［10］的方法進行.

棒狀鏈霉菌中質粒及染色體的提取按Kieser等［8］的方法進行.

1.3 cca R的測序

以ccaR的上下游引物做測序引物，采用Sanger雙脫氧末端終止法進行核苷酸序列測定，測序反應委托Sangon公司完成.測序結果在GenBank進行序列比對（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）.

1.4 重組質粒向S.clavuligerus B71－14的轉移

重組質粒向S.clavuligerusB71－14的轉移采用Kieser等［8］介紹的接合轉移的方法，即以E.coliET12567／p UZ8002／pSET152－ccaR 為 供 體 菌 株，將重組質粒轉移至S.clavuligerusB71－14中.

1.5 發酵液中克拉維酸的生物檢測及HPLC分析

以克雷伯氏肺炎桿菌KlabsiellapneumoniaeATCC29665作為克拉維酸生物活性鑒定指示菌［11］.

發酵液于10 000 r／min離心10 min，所得上清液經0.45μm微孔濾膜過濾，按1∶5的比例與咪唑溶液混勻，30℃反應12 min后冷卻到20℃，生成的衍生物采用Shim－pack VP－ODS（150×4.6）C18色譜柱進行 HPLC分析［12］.

2 實驗結果

2.1 cca R基因的獲得

將ccaR的測序結果在GenBank上做序列比對，結果證明，PCR獲得的ccaR與棒狀鏈霉菌標準菌株NRRL 3585具有99.93%的同源性，證明所得的PCR產物正確，可以用于重組質粒的構建.

2.2 重組質粒pSET152－cca R的構建

參照文獻［13］報道的棒狀鏈霉菌調節基因ccaR的相應核苷酸序列，設計合成如下引物（引物委托北京奧科生物工程有限公司合成）：引物1：5’－TAGGGAGGGGAGAGTCCGA－3’； 引 物 2： 5 ’－TTCAGCGTTGGTTCAGGGA－3’.以棒狀鏈霉菌的染色體為模板，PCR擴增得到1.4 kb的一段含上游啟動區的ccaR基因片段，將該片段經PCR產物回收試劑盒純化與p UCm－T載體進行連接，得到重 組 質 粒 p UCm－T－ccaR；對 p UCm－T－ccaR 進 行EcoRI－BamHI酶切，回收1.4 kb的ccaR 基因片段，與經過同樣酶切的載體pSET152進行連接，連接產物轉化E.coliDH5α，經質粒提取，對重組質粒進行酶切驗證，載體的構建過程及驗證結果見圖1和圖2.

圖1 重組質粒pSET152－cca R的構建過程Figure 1 Construction of the recombinant plasmid pSET152－cca R

圖2 重組質粒pSET152－cca R的驗證Figure 2 Verification of recombinant plasmid pSET152－cca R

由圖2可知，采用EcoRI酶切pSET152－ccaR后得到一條1.4 kb的DNA片段和一條5.5 kb的DNA片段，分別與ccaR基因及載體pSET152的大小相吻合，與理論值相符.并且以待驗證的pSET152－ccaR質粒為模版，PCR擴增ccaR基因的引物和條件進行PCR擴增，結果能得到1.4 kb的ccaR基因片段，表明此重組質粒為正確的重組質粒pSET152－ccaR.

2.3 pSET152－cca R向棒狀鏈霉菌的接合轉移

將驗證正確的pSET152－ccaR電轉至E.coliET12567／p UZ8002 中，所 得 的 轉 化 子E.coliET12567／p UZ8002／pSET152－ccaR 與S.clavuligerusB71－14進行接合轉移，從AS－1培養基中挑取單個接合子至含有萘啶酮酸（25μg／m L）和阿泊拉霉素（25μg／m L）的營養瓊脂平板上，再影印至含有和不含有卡那霉素（50μg／m L）的營養瓊脂平板上.最后，挑選出抗阿泊拉霉素但對卡那霉素敏感的菌株即為接合子.提取接合子中的質粒進行驗證，結果與由大腸桿菌中所提取的質粒相一致，表明重組質 粒 pSET152－ccaR 已 轉 入S.clavuligerusB71－14中.

2.4 轉化子的驗證

載體pSET152含有一個att P位點，可以特異性地插入到鏈霉菌基因組中的att B位點，重組質粒pSET152－ccaR 轉入S.clavuligerusB71－14后，將以整合到基因組上的插入方式將其攜帶的ccaR同時插入到S.clavuligerusB71－14的attB位點（圖3），從而使其增加了一個拷貝的ccaR基因.

圖3 pSET152－cca R 插入 S.clavuligerus B71－14染色體的示意圖Figure 3 Procedure of pSET152－cca R inserted intochromosome of S.clavuligerus B71－14

將上述接合平板上長出的阿泊拉抗性菌落轉接于含相應抗生素的YMGA平板上，28℃培養3～5 d，直至孢子出現，收集孢子，將孢子在不含抗生素的YMGA培養基上進行松弛培養，并在該培養基上傳代3次，仍具有抗性的菌株即為插入了重組質粒pSET152－ccaR的菌株，將該突變株命名為S.clavuligerus：：ccaR.

根據棒狀鏈霉菌attB位點兩側的序列設計一對 引 物 （圖 4）P1：5’－AGCGGCCAAAGGGAGCAGACTGTAA－3’；P2：5’－CAGGATTCGAACCTGGGAAGGCTGA－3’，分別以S.clavuligerus：：ccaR及出發菌株S.clavuligerusB71－14的基因組DNA為模板，進行PCR驗證，結果如圖4.

由圖4可知，以S.clavuligerus：：ccaR的基因組DNA為模板的PCR產物在6～7 kb之間，與理論值6.9 kb（6.9 kb的pSET152－ccaR插入S.clavuligerus的attB位點）相吻合；而以出發菌株S.clavuligerusB71－14的基因組DNA為模板不能得到PCR產物（att B兩引物之間只有60 bp），說明S.clavuligerus：：ccaR為pSET152－ccaR整合插入到S.clavuligerusB71－14的attB位點所得的突變株.

圖4 突變株S.clavuligerus：：cca R的PCR驗證Figure 4 PCR verification of S.clavuligerus：：cca R

2.5 S.clavuligerus：：cca R產酸能力的測定

挑取突變菌株及一株原始對照菌株在豆粉培養基中分別進行發酵培養，測定發酵液中的克拉維酸含量，結果突變菌株的克拉維酸產量最高（表1中M－1）可達820.91 mg／L，較原始對照菌株提高了54%（表1）.

表1 突變菌株及原始菌株發酵液中克拉維酸產量的HPLC測定結果Table 1 HPLC analysis result of clavulanic acid production of original strain and the mutants

2.6 S.clavuligerus：：cca R的遺傳穩定性實驗

將表1中產酸量最高的突變株M－1在YMGA培養基斜面上進行傳代培養，每轉接一次同時轉入發酵培養基中，搖瓶發酵后HPLC法測定克拉維酸的效價，結果如表2所示.

表2 S.clavuligerus：：cca R的遺傳穩定性Table 2 Hereditary stability of S.clavuligerus：：cca R

由表2的傳代實驗結果可知，S.clavuligerus：：ccaR在5代之內產酸量較穩定，繼續傳代，則菌種的產酸量下降較明顯，所以應盡量控制傳代次數在5代以內.

3 結果與討論

隨著克拉維酸生物合成途徑及基因調控的逐漸明確，在常規誘變、原生質體融合的基礎上可以寄希望于通過基因工程的方法來獲得克拉維酸高產菌株［4］.

頭霉素C是棒狀鏈霉菌的抗生素類代謝產物之一，與克拉維酸的代謝途徑彼此獨立又關系密切，克拉維酸合成酶基因簇和頭霉素C合成酶基因簇相鄰，且受相同的調節基因ccaR的調控，而棒狀鏈霉菌中一種代謝產物的阻斷往往會導致其它代謝產物產量的提高［14］.基于上述原因，Paradkar等［15］對野生型棒狀鏈霉菌的lat基因進行插入突變，該基因編碼賴氨酸ε－轉氨酶（該酶是頭霉素C合成途徑中的關鍵酶）［16］，結果獲得了頭霉素C合成停止而克拉維產酸量為原始菌株的2.5倍的高產菌株，是采用基因工程的方法對棒狀鏈霉菌進行改造的成功典范.國內王永華［17］、舒楊等［18］也曾采用類似的方法分別獲得了克拉維酸產量分別為原始菌株1.8倍和2.67倍的高產突變株.

本課題曾選擇對棒狀鏈霉菌進行紫外誘變獲得了產量為原始菌株1.91倍的高產菌株S.clavuligerusB71－14［19］，并對該誘變高產菌株進行了lat基因的插入突變，獲得了產酸量進一步提高的工程菌株［20］.在前面研究的基礎上，本研究嘗試在高產菌株S.clavuligerusB71－14中擴增對克拉維酸合成具有正調控作用的調節基因ccaR，以期為構建棒狀鏈霉菌高產菌株提供又一可行途徑.

本實驗嘗試增加棒狀鏈霉菌中的ccaR基因拷貝以提高克拉維酸的產量，構建了重組質粒pSET152－ccaR，并將其轉入E.coliET12567中獲得了接合轉移的供體菌E.coliET12567／p UZ8002／pSET152－ccaR，通過大腸桿菌與棒狀鏈霉菌的接合轉移實驗成功的將重組質粒pSET152－ccaR轉入了S.clavuligerusB71－14中，由于載體pSET152含有一個att P位點，可以特異性的插入到鏈霉菌基因組中的att B位點，實現了在S.clavuligerusB71－14基因組中增加一個拷貝ccaR基因的目的，該方式是整合到基因組上的插入方式，所構建的基因工程菌株穩定性較高，易于進行工業化生產，為棒狀鏈霉菌克拉維酸高產菌的選育提供了又一可行性途徑.

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Study on application ofccaRStreptomycesclavuligerusto increase clavulanic acid production

ZUOZhihan，ZHENGJinhui

（a.College of Life Science，b.Tianjin Key Laboratory of Cyto－Genetical and Molecular Regulation，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

Clavulanic acid positive regulation geneccaR was amplified inStreptomycesclavuligerusB71－14.ccaR expression plasmid pSET152－ccaR was constructed and transformed intoS.clavuligerusB71－14 by conjugation.Theatt Psite in pSET152－ccaR could be inserted intoattBsite ofS.clavuligerusB71－14，and an extra copy ofccaR was inserted into the chromosome ofS.clavuligerusB71－14.The clavulanic acid yield of the obtained mutantS.clavuligerus：：ccaR can reach 820.91 mg／L，which is 1.54 times of that withS.clavuligerusB71－14.The yield is steady within five generations.

clavulanic acid；Streptomycesclavuligerus；ccaR

Q939.9

A

1671－1114（2011）04－0064－06

2010－04－07

天津師范大學博士基金資助項目（52X0910）

左志晗（1979），女，講師，博士，主要從事微生物活性物質開發方面的研究.

（責任編校 紀翠榮）