幾株益生乳桿菌耐藥性的研究

梁萌萌,張柏林,趙紫華,韓俊華

(1.河北科技大學生物科學與工程學院,河北石家莊 050018;2.北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083)

幾株益生乳桿菌耐藥性的研究

梁萌萌1,張柏林2,趙紫華1,韓俊華1

(1.河北科技大學生物科學與工程學院,河北石家莊 050018;2.北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083)

采用藥敏紙片法研究了戊糖乳桿菌、瑞士乳桿菌、干酪乳桿菌等7株益生乳桿菌對11種抗生素的敏感性,結果發現,7株乳桿菌均耐受多種抗生素。對戊糖乳桿菌LP-B耐四環素基因(tetM,tetS和tetW)的初步研究表明,該四環素耐受基因不位于基因組DNA上,是否存在于質粒上及其該基因的轉移性等尚有待于進一步研究。

益生菌;乳桿菌;耐藥性

乳酸菌是一大類能發酵葡萄糖(或其他可利用的碳水化合物)產生乳酸的細菌。它們大多是來源于人或動物腸道的正常菌群,包括乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌等多個菌屬,是迄今為止廣泛使用的一類益生菌,在醫藥保健、食品、飼料等各個領域發揮了重要作用。

傳統的乳酸菌菌種,如嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌在安全應用上已有很長的歷史,被認為是沒有致病可能性的微生物。目前新的益生乳酸菌菌種不斷被開發出來進入市場,這些新菌種是否具有傳統菌種的安全性,已引起國內外專家的極大爭論。所以,重新評價它們的安全性是十分必要的。乳酸菌等益生菌的耐藥性評價是益生菌安全評價的一項重要內容。有研究表明,用于生產酸奶、保健品的乳桿菌、雙歧桿菌和鏈球菌等具有耐藥性且攜帶耐藥基因[1-2]。一般認為,如果沒有抗生素的廣泛使用等選擇性壓力的存在,對益生菌傳遞耐藥性的憂慮是沒有必要的。但當抗生素濫用已成為一種嚴重的社會問題時,監測益生菌的耐藥性就顯得非常必要和迫切了。

近十年來,國外在益生菌的耐藥性方面做了大量研究工作。D’AIMMO等較系統地報道了雙歧桿菌、乳桿菌、片球菌等對卡那霉素、萘啶酮酸、多粘菌素B等的抗性以及與抗性有關的基因,如Bif idobacterium longum抗四環素(tetracycline)的基因tetW,干酪乳桿菌(L actobacillus casei)抗四環素和紅霉素(erythromycin)的質粒基因tetM和ermB等[1]。TOOMEY等則進一步研究報道了戊糖乳桿菌(L actobacillus plantarum)的抗四環素基因tetM在菌株間的轉移[3]。這種抗藥基因在菌種間的轉移對于人類將是很大的威脅。

目前中國還少見由益生菌引起人體感染和患病的報道,也缺乏益生菌耐藥性及人群使用后的流行病學調查資料。中國對益生菌耐藥性的研究只局限在表觀分析上,尚沒有對耐藥基因的系統研究報道。

本研究將對分離自食品、保健品中的幾株益生乳桿菌進行耐藥性分析,了解菌株的耐藥性,為進一步系統研究益生菌的耐藥性及安全性提供有價值的資料,也將有助于促進益生菌安全性評價方法和安全性評價體系的建立,促進中國益生菌市場的健康發展,使益生菌更好地為人們的健康服務。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養基

實驗所用菌種如下,1)戊糖乳桿菌:Ind-1,Ind-3,LP-B,P;2)干酪乳桿菌:D-400;3)瑞士乳桿菌:L H-9,LLB。以上菌種來自北京林業大學食品科學系,均為冷凍干燥菌種。

所用培養基如下:脫脂乳培養基(每100 mL分別加入脫脂奶粉14.0 g、葡萄糖1.5 g、酵母膏0.5 g)、MRS液體培養基、MRS瓊脂培養基。

1.2 藥敏紙片

抗生素藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術開發公司,每片直徑為 6.5 mm;哌拉西林(100μg/片),慶大霉素(10μg/片),紅霉素(15μg/片),四環素(30μg/片),萬古霉素 (30μg/片),氯霉素(30μg/片),青霉素G(10IU/片),環丙沙星(5μg/片),頭孢噻吩(30μg/片),鏈霉素(10μg/片),利福平(5μg/片);質量完全符合 WHO標準規定。

1.3 儀器和試劑

儀器:血球計數板、XPX-250B-Ⅱ生化培養箱、潔凈工作臺、分析天平、顯微鏡、高壓滅菌鍋等。

試劑:無水乙醇、氯化鈉、酵母膏、脫脂奶粉等。

1.4 菌種活化

將一定量的冷凍干燥菌種在滅菌的0.85%(質量分數)的生理鹽水中復水,在脫脂乳培養基和MRS液體培養基中逐級活化,待活力恢復后,再以1%(體積分數)接種量接種至MRS液體培養基,于37℃恒溫培養10 h,作為試驗菌種備用。

1.5 藥敏紙片法測定菌種耐藥性

1.5.1 接種、藥敏紙片貼放及培養

吸取試驗菌菌液1 mL(約1.5×108cfu/mL)于直徑90 mm滅菌培養皿中,傾倒約15 mL的MRS瓊脂培養基,混勻,待培養基凝固后,在室溫下干燥5 min。用無菌鑷子將藥敏紙片緊貼于瓊脂表面,各紙片中心相距大于24 mm,紙片距平板內緣大于15 mm,每皿貼放3片。室溫放置1.5 h,然后置于37℃培養,24 h后用精確度1 mm的游標卡尺測量并記錄抑菌圈直徑。每種抗生素均設3個重復,結果取平均值。

以標準敏感菌株金黃色葡萄球菌ATCC 25923(Staphylococcus aureusATCC 25923)為質控菌 ,操作同上。

1.5.2 受試菌對抗生素的敏感性判斷

受試菌株對多種抗生素的藥敏性參照 WHO提供的NCCLS最新標準(見表1)進行判斷,報告該受試菌對該抗生素是敏感(susceptible,用S表示),耐藥(resistant,用R表示),還是中度敏感(intermediate,用 I表示)。

表1 試驗用藥敏紙片含藥量及抑菌圈直徑判斷標準Tab.1 Antibiotic susceptibility test discs and criterion for inhibitory result

1.6 抗藥基因的檢測

乳桿菌基因組DNA的提取參照 GIRAFFA等人的方法[4]進行。

以tetM,tetS和tetW為引物,通過PCR基因擴增檢測戊糖乳桿菌LP-B對四環素的抗藥性。引物由北京華大基因公司合成,其序列及相關 信息見表2。

表2 檢測四環素抗性基因的引物Tab.2 Primers used for PCR detection of tetracycline resistance genes

以戊糖乳桿菌LP-B的基因組DNA為模板,PCR反應條件如下:94℃預變性3 min,94℃變性1 min,52～54℃退火30～60 s,72℃延伸1 min,共30個循環,72℃延伸10 min[7]。反應結束后取1.0%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳(100 V,4℃),經染色,紫外燈下觀察并照相記錄。

2 結果與分析

2.1 乳桿菌的耐藥性

將貼放藥敏紙片后培養24 h的培養皿取出,測量各培養皿中藥敏紙片產生的抑菌圈的大小。結合表1的判斷標準得出藥敏性結果,見表3。

表3 7種受試菌對11種抗生素的藥敏性試驗結果Tab.3 Antibiotic resistance results for 7 strains tested with 11 antibiotics

由表3可見,4株戊糖乳桿菌有相似的耐藥譜,只是對于哌拉西林、頭孢噻吩、氯霉素、四環素、利福平有差異。Ind-3對上述4種抗生素有耐藥性,其他3株菌沒有耐藥性。

2株瑞士乳桿菌的耐藥譜也相似,但是L H-9對四環素中度敏感而LLB對其有耐藥性。由以上結果可以看出同一屬的不同菌株的抗藥性也是有差異的。

所有菌株對青霉素 G、環丙沙星、鏈霉素、慶大霉素、萬古霉素耐藥,對紅霉素都不耐藥。對于哌拉西林、頭孢噻吩和氯霉素,除Ind-3耐藥外其他都不耐藥。L H-9,LLB和 Ind-3對利福平耐藥,其他不耐藥。對于四環素,除 P,LP-B,D-400和L H-9菌株外均耐藥。具有這樣耐藥性的乳酸菌進入人體是潛在的不安全因素。可見,建立并加強中國益生菌的耐藥性監測體系,評估目前所使用的菌種的安全性,促進食品和保健品市場的健康發展是極為必要和迫切的。

2.2 乳桿菌耐藥基因的探討

提取戊糖乳桿菌LP-B基因組 DNA后,以tetM,tetS和tetW為引物,通過 PCR擴增檢測其四環素耐藥基因,結果如圖1所示。

由圖1可見,擴增出的條帶和表2中報道的大小不符。因此,初步認為,戊糖乳桿菌LP-B的基因組上不存在四環素抗性基因tetM,tetS和tetW。然而由于該菌株表現出對四環素的抗性,因此抗性基因很可能存在于質粒上,尚有待于后續研究。

圖1 戊糖乳桿菌LP-B基因組DNA的PCR結果Fig.1 PCR result of genomic DNA in L actobacillus pentosusLP-B

3 結 語

全球性的細菌抗生素耐藥是近年來感染性疾病治療所面臨的一大難題。隨著各種新型抗生素在臨床上的應用,細菌的耐藥也越來越廣。目前,國際上對益生菌耐藥性的測定尚缺乏標準程序。筆者參考WHO方法,選擇了抑制細菌細胞壁、蛋白質合成的11種常用抗生素。被檢測的7株益生菌均耐受3種以上的抗生素,屬于多重耐藥菌。而益生菌對人體健康影響的一個非常重要的方面就是其耐藥性,其中萬古霉素尤其受到關注。萬古霉素在臨床上通常被推薦用來治療對甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌的感染,包括敗血癥、心內膜炎、組織和骨感染,通常被認為是抗菌藥物的最后一道防線[8]。許多乳桿菌,如羅伊氏乳桿菌和鼠李糖乳桿菌均具有對萬古霉素的耐藥性,被認為是一種天然特性[9]。本研究測定的7株益生菌均表現出對萬古霉素的耐藥性。這些研究結果提醒人們,在將益生菌應用于食品中時應該謹慎,避免選用有耐藥性的菌種,同時在臨床上則應該選用敏感性藥物。

明確乳酸菌的耐藥機制是十分重要的。研究發現,羅伊氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌中存在R質粒,它攜帶紅霉素、氯霉素、大環內酯類林克霉素等的耐藥基因。大量與耐藥相關的基因都位于質粒和轉座子這些可轉移性遺傳物質上[10]。本研究結果表明,與戊糖乳桿菌LP-B四環素耐藥性相關的tetM,tetS和tetW基因不在基因組DNA上,很可能存在于質粒上。因此,進一步研究其耐藥基因及其轉移性是非常必要的。而且,目前益生菌的安全性問題主要集中在由益生菌所攜帶耐藥基因轉移引起的耐藥性上。可見,益生菌菌株的耐藥性評價是目前國際上益生菌安全評價的首要內容。

[1]D’AIMMO M R,MODESTO M,BIAVATI B.Antibiotic resistance of lactic acid bacteria andBif idobacteriumspp.isolated from dairy and pharmaceutical products[J].International Journal of Food Microbiology,2007,115(1):35-42.

[2]SATO T,IINO T.Genetic analyses of the antibiotic resistance ofBif idobacteriumbifidum strain Yakult YIT 4007[J].International Journal of Food Microbiology,2010,137(2/3):254-258.

[3]TOOMEY N,BOL TON D,FANNING S.Characterisation and transferability of antibiotic resistance genes from lactic acid bacteria isolated from Irish pork and beef abattoirs[J].Research in Microbiology,2010,161(2):127-135.

[4]GIRAFFA G,ROSSETTI L,NEVIANI E.An evaluation of chelex-based DNA purification protocols for the typing of lactic acid bacteria[J].Journal of Microbiological Methods,2000,42(2):175-184.

[5]OLSVIK B,OLSEN I,TENOVER F C.Detection of tetM and tetO using the polymerase chain reaction in bacteria isolated from patients with perodontal disease[J].Oral Microbiology and Immunology,1995,10:87-92.

[6]AMINOV R I,GARRIGUES-J EANJ EAN N,MACKIE R I.Molecular ecology of tetracycline resistance:Development and validation of primers for detection of tetracycline resistance genes encoding ribosomal protection proteins[J].Applied and Environmental Microbiology,2001,67(1):22-32.

[7]OUOBA L I I,LEI V,J ENSEN L B.Resistance of potential probiotic lactic acid bacteria and bifidobacteria of African and European origin to antimicrobials:Determination and transferability of the resistance genes to other bacteria[J].International Journal of Food Microbiology 2008,121(2):217-224.

[8]徐 進,劉秀梅.國內保健食品常用益生菌株的耐藥性分析[J].中國食品衛生雜志,2005,17(2):108-112.

[9]KLEIN G,HALLMANN C,CASES I A,et a1.Exclusion of vanA,vanB and vanC type glycopeptide resistance in strains ofL actobacillus reuteriandL actobacillus rhanmosusused as probiotics by polymerase chain reaction and hybridization methods[J].Journal of Applied Microbiology,2000,89:815-824.

[10]張灼陽,劉 暢,郭 曉.乳酸菌耐藥性的研究進展[J].中國微生態學雜志,2007,19(5):478-480.

Study on antibiotic resistance of probiotic lactobacillus

LIANG Meng-meng1,ZHANGBo-lin2,ZHAO Zi-hua1,HAN Jun-hua1
(1.College of Bioscience and Bioengineering,Hebei University of Science and Technology,Shijiazhuang Hebei 050018,China;2.College of Bioscience and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

In this study,the antibiotic sensitivity of probiotic lactobacillus(L actobacillus pentosus,L actobacillus helveticusandL actobacillus casei)to 11 kinds of antibiotics is tested by antibiotic susceptibility test discs.The results show that each strain is resistant to more than 3 kinds of antibiotics.The tetM,tetS and tetW genes related to tetracycline resistance ofL actobacillus pentosusLP-B are discussed.However,the genes are not found in the genomic DNA ofL actobacillus pentosusLP-B.So the characterisation and transferability of antibiotic resistance genes is yet to be studied.

probiotics;lactobacillus;antibiotic resistance

TS201.3

A

1008-1534(2011)04-0250-04

2011-02-22;

2011-03-29

責任編輯:王海云

河北科技大學2010年度大學生科技創新基金資助項目(10259);河北省高等學校科學技術研究青年基金資助項目(2010240);河北科技大學博士科研基金資助項目(000335)

梁萌萌(1987-),女,河北滄州人,主要從事食品微生物及生物技術方面的研究。

韓俊華博士。E-mail:teach2003@126.com