藜蒿綠原酸的提取及抗脂質過氧化作用研究

付 明, 夏 偉, 劉勝貴, 胡朝暾

(懷化學院民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室;湘西藥用植物與民族植物學湖南省高校重點實驗室; 生命科學系,湖南懷化 418008)

藜蒿 (Artemisia selengensis Turcz)即狹葉艾,又稱蔞蒿、柳蒿等,菊科蒿屬多年生草本植物.分布在我國江西、湖南、湖北、安徽等省,生長于湖邊、沼澤等地,其中蛋白質含量為3.7%、鈣0.73%、抗壞血酸0.049%、胡蘿卜素0.004%、鐵0.003%.藜蒿主治五臟邪氣、風寒濕脾,長毛發、防衰老,健胃、降血壓、防癌等效果明顯[1].其地上嫩莖和地下匍匐莖可食用,由于風味獨特,成為人們喜愛的野生蔬菜.對藜蒿的研究主要集中在栽培、保鮮以及食用加工等方面,其次是抗氧化作用.目前藜蒿大棚種植技術已非常成熟,加深對藜蒿的藥用保健功能的開發正成為研究熱點.

綠原酸作為一種抗氧化劑能清除自由基,有抗菌消炎、抗病毒、降糖、降血脂、保肝利膽等功效[2-6].目前對金銀花、杜仲、忍冬等中藥材的綠原酸提取工藝研究較多,提取綠原酸的方法有醇提法[7-8]、酶解法[9]、超聲波提取法[10]等.綠原酸在327nm處有最大光吸收,因此常采用紫外分光光度法測定其含量.

過氧化脂質 (LPO)的積累會誘發炎癥、免疫失調、動脈粥樣硬化和惡性腫瘤等.檢測LPO的方法[11-12]有硫代巴比妥酸 (TBA)法、熒光法、硫代巴比妥鈉法.綠原酸能抑制靶分子的自動氧化,是許多中藥材的主要藥用成分.因此了解藜蒿中綠原酸的含量、研究綠原酸抗脂質過氧化作用對藜蒿藥用成分的研究具有一定的意義.采用硫代巴比妥鈉法測定LPO,對比研究藜蒿綠原酸與抗壞血酸 (Vc)的抗脂質過氧化作用.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜蒿采自湖南省懷化市.將藜蒿莖放入干燥箱中,65℃干燥后粉碎、過100目篩,保存備用.小鼠由懷化學院實驗室小鼠養殖房提供.

綠原酸標準品 (中國藥品生物制品檢定所110753-200413),硫代巴比妥鈉、甲醇、三氯乙酸 (TCA)、抗壞血酸等均為分析純.

1.2 方法

1.2.1 藜蒿綠原酸提取工藝的優化

1.2.1.1 樣品的制備

取藜蒿粉1.000 g于50 ml錐型瓶中,加入20 ml 70%的甲醇溶液,用0.1 mol/L HCl調pH至3.0,70℃下浸提2 h,再用超聲波 (400 W)處理30 min后抽濾,用氯仿萃取濾液,取上層液旋轉蒸發濃縮,再用70%甲醇定容至50 ml,待測.

1.2.1.2 最大吸收波長、標準曲線及回歸方程的建立

配制0.40 mg/mL綠原酸標準溶液.取綠原酸標準液和藜蒿提取液各0.5 ml分別置于10 ml容量瓶中,加70%甲醇定容至刻度,搖勻靜置10 min,對綠原酸標準液和藜蒿提取液于200～500 nm下掃描.選取二者共同的最大吸收波長,測定不同濃度標準液的吸光值,制作標準曲線,得回歸方程.

1.2.1.3 藜蒿綠原酸含量的測定

取藜蒿粉1.000 g于錐形瓶中加入一定體積一定濃度的甲醇溶液,調至一定pH值,于一定溫度下處理2 h,再用超聲波處理30 min后抽濾,將濾液旋轉蒸發濃縮后定容至50 ml.取0.5 ml提取液用甲醇定容至10 ml,靜置10 min后測A327.根據吸光值通過回歸方程求出X,再按公式 (1)計算綠原酸質量分數：

(X：按回歸方程求得的綠原酸濃度;n：稀釋倍數;W：所取藜蒿粉質量)

1.2.1.4 提取綠原酸的單因素試驗

取藜蒿粉1.000 g于錐形瓶中按1.2.1.3的方法提取綠原酸,分別考察甲醇濃度、料液比、溫度、pH四個因素對藜蒿綠原酸含量的影響.甲醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%,料液比分別為1：10、1：15、1：20、1：25、1：30,pH值分別為1.5、3.0、4.5、6.0、7.5,溫度分別為40、50、60、70、80℃.根據測得的A327通過回歸方程和公式 (1)計算綠原酸含量.試驗重復三次.

1.2.1.5 綠原酸提取工藝的正交試驗

在單因素試驗基礎上,采用L9(34)正交表對上述四個因素進行正交試驗,試驗重復四次.

1.2.2 藜蒿綠原酸抗脂質過氧化作用研究

1.2.2.1 組織勻漿的制備

小鼠禁食24 h后脫臼處死,取出肝臟用冷生理鹽水漂洗后,加入生理鹽水在冰浴中進行勻漿制成5%的肝勻漿.

1.2.2.2 綠原酸與抗壞血酸抗脂質過氧化作用的對比研究

取1.0204 g藜蒿粉在最佳提取工藝下提取綠原酸,蒸發濃縮后用生理鹽水定容至10 ml,相當于1 mg/ml的綠原酸.將試管分為對照組、抗壞血酸組和藜蒿提取液組.先向每支試管分別加入肝勻漿0.5 ml,然后分抗壞血酸組、藜蒿提取液組和對照組,以硫代巴比妥鈉法測A532,并按公式 (2)計算不同濃度的樣品和抗壞血酸對LPO生成的抑制率.試驗重復三次.

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長、標準曲線及回歸方程

紫外分光光度計對綠原酸標準品和藜蒿提取液的掃描結果見圖1,從圖中可以看出藜蒿提取液在250～400 nm處的波峰比較單一,說明純度較高,并且二者在327 nm處都有最大吸光值,故選定測定波長為327 nm.然后分別測定不同濃度的標準綠原酸溶液的A327,以A327對綠原酸標準品濃度繪制標準曲線,得回歸方程A=52.701X+0.0109,相關系數R2=0.9997,說明在綠原酸濃度為0.004～0.020 mg/mL時線性關系良好.

2.2 提取綠原酸的單因素試驗結果

在甲醇濃度、料液比、pH、溫度四個單因素試驗中,除了變動的單因素外其他條件均不變;完成一項單因素試驗后,在考察另一個單因素時該條件就選擇已經確定的最佳條件.甲醇濃度、料液比、pH、溫度對綠原酸的提取率的影響分別見圖2～5.

圖1 藜蒿提取液和綠原酸標準品掃描圖

圖2 甲醇濃度對綠原酸含量的影響

由圖2看出,當甲醇濃度在40%～60%之間時,綠原酸含量隨之增加,當濃度超過60%后綠原酸含量上升不明顯.至70%甲醇以后綠原酸含量甚至有所降低,可能是隨著甲醇濃度的增加,藜蒿中其他一些物質溶出影響了A327.因此確定70%為最佳提取濃度.

圖3 料液比對綠原酸含量的影響

由圖3看出,在料液比為1∶10～1∶20時,綠原酸含量隨甲醇用量增加而升高,當料液比大于1∶20時,綠原酸含量增加較為緩慢,至料液比為1∶25時含量最高 (0.95%).再增加甲醇用量,含量基本不變.考慮成本因素,甲醇用量選20倍于干物料為佳.

圖4 pH值對綠原酸含量的影響

由圖4可知,pH大于3.0時,綠原酸含量隨著pH值的增大而降低.當pH大于6.0時,下降幅度明顯增大,原因可能是綠原酸對堿不穩定.故pH為3.0左右時提取效果較好.

由圖5可知,當溫度在40～70℃之間時,綠原酸含量隨浸提溫度的升高而增加;當溫度大于70℃時,綠原酸含量反而下降,可能是綠原酸分解了.由此確定最佳浸提溫度為70℃.

圖5 溫度對綠原酸含量的影響

2.3 提取綠原酸的正交試驗結果

采用L9(34)正交試驗測定藜蒿中綠原酸的含量,按表1操作浸提藜蒿綠原酸,結果見表1.

表1 L9(34)正交試驗結果

由表1可知,各因素對超聲波輔助浸提藜蒿綠原酸的影響程度為C(溫度)>D(pH)>A(甲醇濃度)>B(料液比).根據直觀分析,甲醇濃度為75%、料液比為1∶25、溫度為70℃、pH為3.0即A3B3C2D2為最佳提取工藝.

按表1確定的最佳提取工藝進行驗證性實驗,綠原酸平均含量為0.98%.

2.4 藜蒿綠原酸與VC抗脂質過氧化作用的對比試驗結果

藜蒿綠原酸與Vc抗脂質過氧化作用的對比試驗結果見圖6.

從圖6可知,當濃度較低時 (0.01～0.2 mg/ml),藜蒿綠原酸與Vc抗脂質過氧化作用隨濃度的增加而增強.在相同濃度下藜蒿綠原酸的抗脂質過氧化作用明顯強Vc,說明藜蒿提取液具有很強的抗脂質過氧化能力.

圖6 綠原酸和Vc對小鼠肝臟LPO生成的影響

3 結論與討論

通過單因素試驗和正交試驗,確定采用超聲波輔助甲醇浸提法提取藜蒿綠原酸的最佳工藝為甲醇濃度75%,料液比1∶25,提取溫度70℃,pH為3.0,此時藜蒿綠原酸的平均含量為0.98%.有關藜蒿綠原酸含量的報道很少,鄭鄂湘用乙醇回流法提取藜蒿綠原酸、高效液相色譜法測其含量,在最佳提取工藝下藜蒿綠原酸含量為1.24%.這與實驗材料、提取方法和測定方法不同有關.

關于藜蒿抗脂質過氧化作用的研究目前尚未見報道,楊安樹等[14]采用Rancimat法研究了藜蒿提取物的抗氧化作用,發現藜蒿提取物對油脂具有明顯的抗氧化作用,且具有劑量效應關系;在乳化體系中提取物的抗氧化效果比在油體系中強.本研究證明藜蒿綠原酸對脂質過氧化作用具有較強的抑制作用,且具有劑量效應.而且藜蒿提取物比Vc具有更強的抗氧化作用,因而是一種具有開發潛力的抗氧化劑.

藜蒿是藥食兩用的植物,保健價值高,在人們越來越重視健康和生活質量的現代社會具有廣闊的應用前景.不斷加深對藜蒿藥用成分,如黃酮、揮發油、綠原酸等的研究正成為目前藜蒿研究的熱點.藜蒿飲料、藜蒿精油、藜蒿粉等保健產品的開發市場潛力較大.

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