藥用植物虎杖和盾葉薯蕷的組織培養

曾漢元, 黃小波, 許方美

(懷化學院生命科學系,湖南懷化 418008)

中藥材虎杖為蓼科多年生草本植物虎杖(Reynoutria japonica)的莖和根,被歷版《中華人民共和國藥典》收載.性味苦寒,具有祛風利濕,祛痰止咳,清熱解毒,活血化瘀等功效.研究表明,虎杖中所含的白藜蘆醇是其有效成分之一[1],具有強心擴血管、抑制血小板聚集、降血脂、鎮咳平喘、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種作用[2],是治療顱內出血、糖尿病、組織癌變和抑制腫瘤發生最有前途的藥物之一[3-5].此外,虎杖嫩莖可以食用,可作為綠色食品來開發.

盾葉薯蕷(Dioscorea zingiberensi)為薯蕷科草質纏繞藤本植物,是一種常用的中草藥,根莖可治療各種急性化膿性感染、軟組織損傷,并有抗腫痛和降血糖的作用,對治療冠心病和腦血管病有特效[6].其根莖含薯蕷皂苷元,是合成甾體激素類藥物的主要原料.近年來的研究表明,對薯蕷皂苷元甾體環的每一次化學修飾,都能產生一種療效奇特的甾體藥物.目前,以薯蕷皂素為原料已合成了300多種激素藥物,展示了薯蕷皂素廣闊的醫藥前景[6].

在虎杖和盾葉薯蕷的組織培養研究方面已有一些報道[7-9],但他們報道的培養基配方中應用的細胞分裂素為激動素 (KT).考慮到KT的價格高且耐熱性較差,因此,我們改用價廉且相對耐熱的6-BA對這兩種藥材進行了組培研究.

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料虎杖采自懷化市賀家田鄉,種植于懷化學院生物園內;盾葉薯蕷采自中方縣盾葉薯蕷良種繁育基地,室內盆栽.

1.2 外植體最佳消毒時間的確定

取虎杖和盾葉薯蕷的嫩芽,流水沖洗干凈;用0.1%升汞溶液作消毒劑,各設計三組不同的消毒時間,分別消毒5 min、10 min和15 min,用無菌水沖洗4～5次,在超凈工作臺內接種在MS基本培養基中,然后放在人工氣候箱中進行培養,一周后觀察,根據滅菌結果確定適宜滅菌時間.每種滅菌時間處理的材料接種6瓶.

1.3 培養基的設計

以MS為基本培養基,附加不同濃度的2,4-D和6-BA(單位：mg/L,下同),各培養基均添加30 g/L蔗糖、8 g/L瓊脂,pH5.8.培養基中激素配比見表2～4,外植體全部采用前面篩選出的適宜滅菌時間進行滅菌.每種配方接種6瓶.

1.4 培養

接種后,放在人工氣候箱中進行培養,培養條件為：溫度20～25℃,濕度70%～80%,誘導愈傷組織時不開燈光;對愈傷組織進行分化培養時,光照強度為20μmol/m2.s,光照時間為12 h/d.

2 結果

2.1 不同滅菌時間處理的結果

采用0.1%升汞的三種不同滅菌時間分別對虎杖和盾葉薯蕷進行滅菌處理的實驗結果 (表1).由表1可知,虎杖和盾葉薯蕷嫩芽的適宜滅菌時間為10 min.

表1 不同滅菌時間處理的結果

2.2 不同濃度激素配比對虎杖愈傷組織的誘導結果

采用不同濃度的生長素和細胞分裂素配比對虎杖愈傷組織的誘導結果,如表2.

表2 不同濃度激素配比對虎杖愈傷組織的誘導結果

由表2可知,在以上6組配方中,以第2組2,4-D 0.2+6-BA 1.0效果最好.

2.3 不同濃度激素配比對盾葉薯蕷愈傷組織的誘導結果

采用不同濃度的生長素和細胞分裂素配比對盾葉薯蕷愈傷組織的誘導結果,如表3.

表3 不同濃度激素配比對盾葉薯蕷愈傷組織的誘導結果

由表3可知,在以上6組配方中,以第6組2,4-D 0.5+6-BA 2.0效果最好.

2.4 盾葉薯蕷愈傷組織的分化培養結果

采用不同濃度的生長素和細胞分裂素配比對盾葉薯蕷愈傷組織進行分化培養的結果,如表4.

表4 盾葉薯蕷愈傷組織的分化培養結果

由表4可知,培養出的愈傷組織轉接到MS+2,4-D 0.5+6-BA 0.1或者MS+2,4-D 0.2+6-BA 0.1的培養基中都能分化出芽,但是后者長勢弱.考慮到細弱的苗在移栽時難以成活,因此,分化培養時以采用前者為宜.

2.5 盾葉薯蕷的生根培養

當盾葉薯蕷的叢生芽長到5～7 cm時,將其分割成單株,然后轉入培養基MS+2,4-D 0.5中培養,20 d后,生根率達80%以上.

2.6 移栽

當根長到5 cm以上且根數達到5條以上時進行煉苗和移栽.先將培養瓶瓶口半開5 d,然后將瓶口全部打開,6 d后取出組培苗,用清水洗凈根系附著的培養基,移栽到經高壓滅菌的腐殖土中,用無菌水一次澆透,放在人工氣候箱中培養,溫度為22～25℃,濕度為70%～85%.6 d后,幼苗葉片顏色呈綠色;15 d后進行換盆移栽,移栽成活率為70%.

3 討論

(1)在對一種新的材料進行組織培養時,首先應該研究適宜的滅菌時間.滅菌時間恰到好處,才能達到“既殺滅微生物又保存盡可能多的活組織細胞”的目的.滅菌是否合適的判斷方法是：如果接種材料大部分發生污染,說明外植體的消毒時間短或者消毒劑濃度偏低;若接種材料雖然沒有污染,但材料已發黃,組織變軟,表明消毒時間過長,組織被破壞死亡;接種材料若沒有出現污染,且生長正常,即可以認為消毒時間合適.

圖1 虎杖愈傷組織

圖2 虎杖愈傷組織直接分化出莖和葉

圖3 盾葉薯蕷的愈傷組織

圖4 盾葉薯蕷的叢生芽

(2)虎杖愈傷組織在弱光照射下,在原培養基中再經過8周培養后直接分化出了莖和葉.可能原因是：在弱光照射下,部分愈傷組織細胞發育出葉綠體,含有葉綠體的細胞合成了一些生長素類物質,從而促進了莖和葉的形成.

(3)Skoog和Miller等提出：在組織培養中,生長素和細胞分裂素的比例決定根和芽的分化：脫分化時生長素低,細胞分裂素高;再分化時生長素高,細胞分裂素低.這一理論對于指導培養基配方的設計、減少實驗工作量具有一定的指導意義.

[1]李易非,李多偉,許慧,等.酶解法提取虎杖中白藜蘆醇的工藝研究 [J].中成藥,2009,31(9)：1449-1451.

[2]潘明新,王曉陽.虎杖的化學成分及其藥理作用 [J].中草藥,2000,23(1)：35-40.

[3]劉銘,劉華,張國平,等.虎杖苷對腦出血性損傷大鼠血清白細胞介素-1β和腦組織Bcl-2蛋白表達的影響[J].中草藥,2010,41(12)：2010-2013.

[4]于柏艷,孫 抒,楊萬山,等.虎杖提取物對人肺癌A549細胞株抑制增殖和誘導凋亡作用的研究 [J].中成藥,2010,32(11)：1972-1976.

[5]王輝,楊再剛,燕樹勛,等.虎杖總蒽醌對糖尿病腎病早期血瘀模型大鼠脂代謝及血液流變性的影響 [J].中國實驗方劑學雜志,2010,16(16)：156-159.

[6]李祥,馬建中,史云東.盾葉薯蕷、薯蕷皂素研究進展及展望 [J].林產化學與工業,2010,30(2)：107-112.

[7]王宇.虎杖的組織培養及高效無性系的建立 [J].江西農業學報,2009,21(3)：73-76.

[8]李瓊,李靜,姜玲,等.盾葉薯蕷愈傷組織的誘導及芽分化與增殖 [J].貴州農業科學,2010,38(7)：15-17.

[9]彭曉英,周樸華,張良波,等.盾葉薯蕷類原球莖的離體誘導及快繁體系的建立 [J].植物遺傳資源學報,2010,11(5)：629-634.