羧甲基殼聚糖對腫瘤生長的影響研究*

劉萬順,鄭美玲,韓寶芹,亢壽海,李 南

(1.中國海洋大學海洋生命學院,山東青島266003;2.江蘇省腫瘤研究所,江蘇南京210008)

羧甲基殼聚糖對腫瘤生長的影響研究*

劉萬順1,鄭美玲1,韓寶芹1,亢壽海2,李 南1

(1.中國海洋大學海洋生命學院,山東青島266003;2.江蘇省腫瘤研究所,江蘇南京210008)

研究評價了不同分子量及不同取代度的3種羧甲基殼聚糖(CM-CTS)對腫瘤生長的影響。用MTT比色法測定3種CM-CTS對人正常肝細胞L02及3株腫瘤細胞:Bel-7402、SGC-7901及Hela生長的影響;EL ISA方法檢測3種CMCTS對2種肝細胞L02及Bel-7402分泌TGF-α及VEGF水平的影響;建立小鼠移植性腫瘤Heps模型,腹腔注射分子量最大的CM-Ⅰ,研究CM-CTS的抑瘤作用。研究結果表明,分子量及取代度不同的3種CM-CTS在0.05～0.8 mg/mL濃度范圍內,對L02細胞增殖具有顯著促進作用,對Bel-7402、SGC-7901及Hela細胞的增殖則具有一定的抑制作用;3種CM-CTS能提高L02細胞TGF-α分泌水平,抑制Bel-7402細胞分泌TGF-α及VEGF水平;在動物水平上,CM-CTS能抑制小鼠Heps腫瘤生長,且量效關系顯著。說明不同分子量及取代度的3種羧甲基殼聚糖對腫瘤生長具一定的抑制作用。

羧甲基殼聚糖;腫瘤;細胞因子

羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl chitosan,CMCTS)是殼聚糖改性研究和應用研究最多的1種殼聚糖衍生物,具有良好的水溶性、優(yōu)良的成膜性和保濕性等,在日化、食品、醫(yī)藥及醫(yī)用生物材料等領域中具有廣泛的應用前景[1]。CM-CTS作為生物醫(yī)用材料在燒傷敷料、防術后黏連材料、藥物載體及酶抑制劑等領域中研究較多[2]。CM-CTS含有-NH2和-COOH,其分子量和羧基取代度不同,使生物學活性存在較大差異。細胞水平的研究證明,CM-CTS具有促進正常細胞生長的作用[3],而其對腫瘤細胞生長的影響則報道較少,故開展CM-CTS對腫瘤生長的影響具有重要的理論意義和實際意義。本實驗旨在研究不同分子量及不同羧化度的CM-CTS對人正常肝細胞L 02及3株腫瘤細胞:Bel-7402、SGC-7901及Hela體外增殖及相關細胞生長因子分泌水平的影響,以及對Heps小鼠腫瘤生長的影響,為CM-CTS在生物醫(yī)用材料領域的應用提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

3種CM-CTS樣品均由本實驗室制備,分別標記為CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ。人正常肝細胞L 02及人肝癌細胞Bel-7402購自中國海洋大學藥物研究所;人胃癌細胞SGC-7901及人宮頸癌細胞Hela由中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所提供。4種細胞均于含10%新生牛血清的RPM I1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng),0.25%胰酶消化傳代;昆明種小鼠,雌雄各半,體質量(20±1)g,由南京安立默實驗動物繁殖中心提供。Heps荷瘤小鼠購自北京鼎國生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

RPM I1640培養(yǎng)基(Gibco),新生牛血清(Hyclone),胰蛋白酶和M TT(Sigma),人TGF-α和VEGF EL ISA試劑盒(上海勁馬實驗設備有限公司),其它試劑均為國產分析純。

真空冷凍干燥機(Labconco),高效液相色譜儀(美國Waters),倒置顯微鏡(日本Olympus),超凈工作臺、BB16FCO2培養(yǎng)箱(上海力申科學儀器有限公司),Rayto2100C酶標儀(深圳雷杜生命科學有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 材料純化及性質研究 CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ樣品于三蒸水中溶解透析,經(jīng)0.22μm濾膜過濾,真空冷凍干燥。GPC-HPLC測定樣品分子量,流動相:0.02M PBS溶液;流速:0.8 mL/min;柱溫:35℃;示差檢測器;右旋糖苷標樣。采用電位滴定法測定羧基取代度[4]。

1.3.2 體外細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期L02、Bel-7402、SGC-7901及Hela細胞,胰酶消化后,調整細胞濃度為3×104/mL,接種于96孔板,每孔200μL。實驗設不同濃度CM-CTS實驗組,細胞對照組及空白對照組。常規(guī)培養(yǎng)24 h待細胞貼壁生長良好時,吸去原培養(yǎng)基,實驗組分別加入含不同濃度CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ的RPM I1640培養(yǎng)基,每個濃度設5個重復孔,細胞對照組加入等量RPM I1640培養(yǎng)基。各組細胞分別培養(yǎng)2 d及4 d,M TT法測定其在492 nm處測吸光值,計算細胞相對增殖率(RGR):

上式中,D0,D1及D2分別為空白組,實驗組及對照組的吸光值。

1.3.3 3種CM-CTS對L 02及Bel-7402細胞分泌生長因子水平的影響 細胞培養(yǎng)方法同1.3.2,實驗設不同濃度CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ實驗組、細胞對照組及空白對照組。不同組別的細胞采用無血清培養(yǎng)基。24 h后收集培養(yǎng)液,離心、收集上清液,按照EL ISA試劑盒說明書步驟進行操作,分別測量L02及Bel-7402細胞分泌TGF-α水平及Bel-7402細胞分泌VEGF水平。

1.3.4 體內抑瘤實驗 取腫瘤生長旺盛的荷瘤小鼠,頸椎脫臼處死,無菌條件下取出瘤塊,制備成單細胞懸液,調節(jié)細胞濃度為1×108/m L,接種于健康小鼠右前肢腋窩皮下,每只0.2 m L[5]。接種24 h后隨機分為低、中、高劑量實驗組和對照組,每組10只。由于實驗經(jīng)費和實驗時間的限制,作者選擇分子量最大的CM-Ⅰ作為受試物。實驗組動物分別以75、150和300 mg·kg-1劑量腹腔注射CM-Ⅰ給藥,隔日1次,連續(xù)2周。停藥24 h后頸椎脫臼處死小鼠,稱體質量,解剖剝離瘤塊,稱瘤質量。對照組平均瘤質量1 g以上可進行結果分析,計算抑瘤率:抑瘤率=(1-實驗組平均瘤質量/對照組平均瘤質量)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,組間比較采用方差分析(one way ANOVA),P<0.05有顯著性差異。

2 結果

2.1 3種CM-CTS理化性質

3種CM-CTS樣品均有良好的水溶性,分子量及羧化度測定結果如表1所示,其中CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ的分子量依次減小;CM-Ⅰ及CM-Ⅲ的羧基取代度相近,CM-Ⅱ羧基取代度較低。

表1 3種CM-CTS的主要物理性質Table 1 The Physical p roperties of three CM-CTS samp les

2.2 CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ對4種細胞增殖的影響

由表2可知,在0.05～0.8 mg/mL濃度范圍內作用2 d時,CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ對人正常肝細胞L02的增殖均有顯著的促進作用,RGR平均值基本一致,分別為110.8%、114.4%和113.4%。但3種受試物促生長作用的最優(yōu)濃度不同,分別為0.3、0.8和0.1 mg/mL。在實驗濃度范圍內,CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ對人肝癌細胞Bel-7402的生長表現(xiàn)出一定程度的抑制作用(P<0.05),三者的抑制作用濃度范圍分別為0.1～0.8 mg/mL(2 d)、0.05～0.8 mg/mL(2 d)及0.1～5.0 mg/mL(2 d),作用4 d時,生長抑制作用減弱;CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ對人胃癌細胞SGC-7901的生長表現(xiàn)出一定程度的抑制作用(P<0.05),在5.0 mg/mL時抑制效果最為明顯,RGR可分別達55.6%(2 d)、79.1%(2d)及72.4%(2 d);對于Hela細胞,CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ在低濃度范圍內對其生長作用不明顯,在5.0 m g/m L時有一定程度的抑制作用,RGR分別為67.9%(2 d)、83.2%(2 d)及82.2%(2 d)。

2.3 CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ對細胞因子TGF-α及VEGF分泌的影響

TGF-α是1種參與調節(jié)正常細胞和腫瘤細胞增殖、分化的細胞因子,是正常肝細胞、肝癌細胞增殖分化過程中必不可少的有絲分裂原。由圖1所示,CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ均顯著促進人正常肝細胞L 02分泌TGF-α水平,其作用的濃度范圍分別為0.1～5.0、0.1～0.8和0.1～5.0 mg/m L;同時,CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ均顯著抑制人肝癌細胞Bel-7402分泌TGF-α水平,抑制作用的濃度范圍分別為0.1～5.0、0.1～0.3及0.1～5.0 mg/mL。

VEGF是腫瘤誘導產生新生血管的最主要的細胞因子。由由圖1可見,CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ能顯著抑制人肝癌細胞Bel-7402分泌VEGF水平,三者抑制作用的濃度范圍分別為0.1、0.1～5.0和0.1～5.0 mg/mL。

表2 3種CM-CTS對4種細胞增殖的影響Table 2 Effects of three CM-CTSon the proliferation of four cells(n=5,?x)

圖1 3種CM-CTS對TGF-α及VEGF分泌的影響Fig.1 Effect of three CM-CTSon the secretion of TGF-αand VEGF(n=3,x?±SD,*P<0.05 vs control)

2.4 CM-Ⅰ對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

由表3和圖2可見,不同劑量的CM-Ⅰ均能抑制小鼠實體瘤的生長。CM-Ⅰ在75,150及300 mg·kg-1時抑瘤率分別為12.9%,18.2%及22.1%(見表3)。與對照組相比,CM-Ⅰ對小鼠體重無顯著性影響。在實驗過程中,實驗組小鼠生長狀態(tài)較好,主要表現(xiàn)為活動、飲食量增加,皮毛光亮,表明CM-CTS對實驗動物機體毒性較小。

表3 CM-Ⅰ對Heps實體瘤模型小鼠腫瘤生長的影響Table 3 Effect of CM-Ⅰon the grow th of Heps tumo r in mice(n=10,?x±SD)

圖2 CM-Ⅰ對小鼠Heps腫瘤形態(tài)的影響Fig.2 Effect of CM-Ⅰon the morphology of Heps tumo r

3 討論

本文主要研究CM-CTS對腫瘤生長的影響。體外實驗表明,CM-CTS對正常細胞和腫瘤細胞生長的影響表現(xiàn)出了相反的影響結果,3種不同分子量不同羧化度的CM-CTS在一定濃度范圍內,對人正常肝細胞L 02的增殖均具有顯著的促進作用,但對3株腫瘤細胞:Bel-7402、SGC-7901及Hela的增殖則表現(xiàn)出輕微抑制作用。在本文的研究中,CM-CTS的分子量和羧化度在對正常細胞和腫瘤細胞生長的影響中,沒有較大的不同。體內實驗顯示,腹腔注射CM-Ⅰ機體毒性較小并對小鼠Heps實體瘤生長具劑量相關抑制作用,實驗結果進一步驗證了CM-CTS的抗腫瘤生長作用。

CM-CTS對正常細胞生長的促進作用已經(jīng)在正常皮膚成纖維細胞[6]及角質形成細胞[3]的生長中得到驗證;殼聚糖對腫瘤細胞生長的抑制作用分別在宮頸癌Hela細胞[7]及艾氏腹水瘤(EA T)細胞[8]生長研究中得到驗;CM-CTS對人高轉移肺癌細胞95-D的生長具抑制作用[9]。CM-CTS對正常細胞和腫瘤細胞生長的不同方向的調節(jié)作用,可能與正常細胞和腫瘤細胞結構不同有關,其作用機制有待進一步研究。

目前,CM-CTS體內抑制實體瘤生長的作用機制尚未清楚。楊靖亞等[10]發(fā)現(xiàn)灌胃給藥CM-CTS能促進機體分泌IFN-γ、IL-2,增強N K細胞活性等增強機體免疫力,從而對S180實體瘤生長具抑制作用。劉艷如等[11]研究發(fā)現(xiàn)CM-CTS能提高小鼠巨噬細胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù),對小鼠外周血清溶血素抗體的生成和血凝素抗體積數(shù)生成有顯著影響。因此,腹腔注射CM-CTS對Heps實體瘤生長的抑制作用的機制可能與其對機體免疫調節(jié)有關。

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Study on the Antitumo r Effect of Carboxymethyl Chitosan

L IU Wan-Shun1,ZHENG M ei-Ling1,HAN Bao-Qin1,KANG Shou-Hai2,L INan1
(1.College of Marine Life Science,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.Institute of Oncology of Jiangsu,Nanjing 210008,China)

The effects of three carboxymethyl chitosan(CM-CTS)with different molecular weights(MW)and different substituted degrees(DS)on the grow th of tumo r w ere studied.Effects of CM-CTS on the grow th of human no rmal liver cell L 02 and three tumo r cell lines:Bel-7402,SGC-7901 and Hela were measured by M TT assay,w hile levels of transforming grow th factor-α(TGF-α)and vascular endothelial grow th factor(VEGF)secreted by L 02 and Bel-7402 cells were measured by EL ISA.In vivo,tumo r modelsof Hep smice w ere established and CM-CTSwith the highestmolecular weight w as administered through intraperitoneal injection to investigate tumor inhibitory effect.CM-CTSwith different MW and different DS all p romoted the proliferation of L02 cells but slightly inhibited that of Bel-7402,SGC-7901 and Hela cellswithin the concentration of 0.05—0.8 mg/mL.They also could imp rove the TGF-α secretion of L02 cells,w hereas decreased TGF-αand VEGF secretion of Bel-7402 cells.CM-CTSalso inhibited the grow th of Heps tumor in a dose-dependentmanner.CM-CTSexhibited inhibitory effect on the grow th of tumo r bo th at cellular level and tissular level.

carboxymethyl chitosan;cancer;cytokine

[Q539+.7];R735.7

A

1672-5174(2011)09-036-05

國家高技術研究發(fā)展計劃重點項目(2007AA091603)資助

2011-01-17;

2011-04-18

劉萬順(1950-),男,博導,從事生物化學與海洋生物材料研究。E-mail:WanshunLiu@hotmail.com

責任編輯 朱寶象