一種新型希夫堿Cu(Ⅱ)配合物的合成、表征及與DNA的相互作用*

鄭玉萍,范玉華,張 霞,王 強,劉善斌,畢彩豐

(中國海洋大學化學化工學院海洋化學理論工程技術教育部重點實驗室,山東青島266100)

一種新型希夫堿Cu(Ⅱ)配合物的合成、表征及與DNA的相互作用*

鄭玉萍,范玉華**,張 霞,王 強,劉善斌,畢彩豐

(中國海洋大學化學化工學院海洋化學理論工程技術教育部重點實驗室,山東青島266100)

制備了2-氨基嘧啶縮鄰香草醛希夫堿配體C12H11N3O2(HL),將其與Cu(Ⅱ)作用合成了1種新型的銅配合物{[CuL(NO3)(C2H5OH)]·2H2O}。通過元素分析、紅外光譜、紫外-可見光譜、TG-DTG及摩爾電導分析等手段對合成的配合物進行了表征,推測了配合物可能的結構,銅為六配位,八面體結構:配體中-C=N-上的N原子、嘧啶環上的N原子、酚羥基上的O原子均參與了配位,配合物中硝酸根以雙齒形式參與配位,溶劑分子以配位形式存在,水以結晶形式存在。利用紫外-可見吸收光譜、熒光光譜、黏度測試、電化學方法研究了配合物與DNA的相互作用,實驗結果表明,配合物與DNA之間通過插入作用結合,并得出配合物與DNA的結合常數為Kb=8.12×104L·mol-1。

希夫堿;Cu(Ⅱ)配合物;合成;表征;DNA;插入作用

希夫堿中-C=N-鍵的存在提供了孤電子,使得希夫堿配體具有極大的靈活性和良好的配位能力,是配位化學、生命科學研究的重要領域[1-3]。嘧啶環是生物分子和醫藥中有較好活性的基團,所以嘧啶類化合物一直引起人們的重視。嘧啶類化合物與金屬離子形成的配合物作為動物飼料添加劑,不僅能增強原藥物的活性,延長特效期和半衰期,而且還能降低毒性[4-6]。DNA是染色體的主要化學成分,遺傳信息的載體,研究物質與DNA的作用,對遺傳病、腫瘤、心腦血管疾病、病毒細菌寄生蟲病和職業病等的診斷具有重要意義。隨著人們對金屬配合物與DNA相互作用的研究,普遍認為金屬配合物與DNA共有3種作用方式:靜電作用、溝槽結合和插入結合[7-9],而許多重要應用要求配合物以插入方式與DNA結合,近年來研究嘧啶類配合物的報道相對較少,因此研究此類配合物對研究藥物對DNA的作用有著重要意義。本文利用2-氨基嘧啶和鄰香草醛合成了嘧啶類的希夫堿Cu(Ⅱ)配合物,并用元素分析、IR、UV、TG-TDG及摩爾電導分析等手段對其進行了表征,用紫外吸收光譜、熒光光譜法、黏度測試、電化學方法研究了配合物與DNA的相互作用,實驗結果表明,配合物與DNA之間通過插入作用結合。

1 實驗材料儀器與方法

1.1 試劑與儀器

2-氨基嘧啶,鄰香草醛,無水乙醇,Cu(NO3)2·3H2O均為分析純試劑,使用前未經過進一步純化。鮭魚精DNA,配合物溶液用5 mmol·L-1Tris-HCl、50 mmol·L-1NaCl(p H=7.2)緩沖溶液配制。Vario-EL-cube型元素分析儀,DDS-312A型電導率儀,AVA TAR 360 FT-IR型紅外光譜儀,TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計,NETZSCH熱重分析儀,L K2006電化學工作站。

1.2 實驗方法

1.2.1 配體的合成 稱取0.95 g(10 mmol)2-氨基嘧啶于100 m L圓底燒瓶中,并用適量無水乙醇溶解,在攪拌回流下逐滴加入1.52 g(10 mmoL)鄰香草醛的乙醇溶液,在60℃下繼續攪拌回流4 h,得褐色液體。將上述褐色液體減壓蒸餾后,向濃縮液中加入石油醚,即產生淡黃色沉淀。抽濾,沉淀用石油醚洗滌數次后,真空干燥保存。產率:58.6%,熔點:195.2～196.1℃,化學式為:C12H11N3O2。反應方程式為:

1.2.2 配合物的合成 稱取1.15 g(5 mmol)上述配體并溶于適量無水乙醇中,加入0.604 g(2.5 mmol)Cu(NO3)2·3H2O,在60℃下繼續攪拌回流2 h,產生草綠色沉淀,過濾并用無水乙醇洗滌多次,得到固體配合物。

1.2.3 紫外-可見吸收光譜研究 在緩沖溶液(p H=7.2)中,固定配合物溶液的濃度,逐漸增加DNA的濃度,使兩者濃度比在0.6～1.8范圍內,直至飽和,進行紫外-可見光譜掃描。

1.2.4 熒光光譜研究 (1)在p H=7.2的緩沖溶液中,固定配合物溶液的濃度,逐漸增加DNA的濃度,使兩者濃度比在0.6～1.8范圍內,記錄其熒光發射光譜圖。

(2)研究鈉離子濃度對配合物-DNA體系熒光強度的影響,在p H=7.2的無鈉離子緩沖溶液中固定DNA和配合物的濃度逐漸增加氯化鈉的濃度測定。

(3)研究[Fe(CN)6]4-濃度對配合物-DNA體系的熒光強度影響,在p H=7.2的緩沖溶液中固定DNA和配合物的濃度逐漸增加[Fe(CN)6]4-的濃度測定。

1.2.5 黏度研究 樣品均溶解在p H=7.2的Tris-HCl緩沖溶液中,在測定黏度時,溫度恒定在(25±0.1)℃,在烏貝洛德黏度計上進行。測定液按固定DNA的濃度,逐漸增加配合物濃度配置,測定液的相對粘度按下式計算[7]:η=(t-t0)/t0,式中t0表示緩沖液流經烏氏粘度計的時間,t為DNA溶液(含濃度不等的配合物溶液)流經烏氏黏度計的時間。以(η/η0)1/3對r(r=[配合物]/[DNA])作圖,其中η0為未加配合物時DNA溶液的相對粘度。

1.2.6 電化學研究 在p H=7.2的緩沖溶液中,加入50 mmol·L-1配合物,在L K2006電化學工作站上記錄其循環伏安曲線(CV),然后加入一定量的魚精DNA,充分作用后記錄其CV曲線。儀器條件:起始電位-1.0 V,最高電位1.0 V,掃速0.062 V/s。

2 結果與討論

2.1 配合物的表征

2.1.1 元素分析及配合物的摩爾電導率 配體及配合物的C、N、H含量由Vario EL cube型元素分析儀測定,Cu(Ⅱ)離子含量用重量法測定。配體的元素分析結果與按化學式C12H11N3O2的計算值相符。Wmea/%:C,62.84;H,4.95;N,18.91;Wcal/%:C,62.87;H,4.84;N,18.33。配合物的元素分析結果按化學式C14H18N4O6Cu的計算值相符。Wmea/%:C,40.35;H,4.88;N,13.43;Cu,15.48;Wcal/%:C,40.05;H,4.80;N,13.34;Cu,15.13。以二甲基亞砜為溶劑,濃度為1.02×10-4mol·L-1時,測得Cu(Ⅱ)配合物的摩爾電導率為15.4 S·cm2·mol-1,其數值小于35S·cm2·mol-1,可以認為這些配合物為非電解質[10],即NO-3參與了配位。

2.1.2 紅外光譜分析 配體和配合物在3 300～3 350 cm-1區域內不存在雙齒吸收峰,說明伯胺上的氫與羰基氧縮合失水形成希夫堿結構,所以不存在υN-H結構,Cu(Ⅱ)配合物在此區間出現寬吸收峰,說明配合物中存在結晶水或存在乙醇分子中羥基的伸縮振動[10-11]。配合物在1 613.6 cm-1處有較強的吸收振動峰,與配體的振動頻率1 646.3 cm-1相比,發生了紅移,表明配體亞氨基C=N上的N原子在配合物中發生了配位,510.3 cm-1處新振動峰出現,可歸屬為M-N配位鍵的形成。配體的酚羥基伸縮振動在1 241.8 cm-1處,而Cu(Ⅱ)配合物的酚羥基伸縮振動在1 217.1 cm-1處,且在460.2 cm-1處出現新的伸縮振動峰,也證明了氧原子與金屬離子形成了M-O配位鍵[10]。配體中嘧啶環的骨架伸縮振動在出現在1 601.36 cm-1,平面中環變形位于673.78 cm-1處,與配體相比,Cu(Ⅱ)配合物嘧啶環的骨架伸縮振動出現在1 564.6 cm-1處,發生了紅移,表明嘧啶環的N原子發生了配位[12]。配合物在1 540.1,1 245.8和1 070.1 cm-1出現吸收峰,這表明配合物中存在配位的NO-3,合成的配合物中|υ1-υ3|>180 cm-1,Cu(Ⅱ)配合物存在雙齒配位的NO-3[11]。

2.1.3 紫外-可見光譜分析 在二甲亞砜溶液中測定了配體和配合物(濃度為100μg·mL-1)的紫外-可見吸收光譜,紫外-可見光譜數據如表1所示。配體的紫外吸收峰位置在267與307 nm處,分別屬于苯環和C=N的π-π*吸收帶。與配體比較,配合物的2個紫外吸收峰位置發生了紅移[13],且摩爾吸光系數變小,進一步說明了C=N中的氮原子與金屬離子發生配位,形成了希夫堿配合物。

表1 配體及配合物的紫外-可見光譜數據Table 1 UV-Vis data for ligands and comp lex

2.1.4 配合物的熱分解分析 配合物的熱分解是在室溫至800℃溫度區間內測定的,如圖1所示。配合物在25～120℃溫度范圍,失重率為8.01%(理論計算值為8.50%),相當于失去兩分子的水,第二步和第三步熱分解區間為200～550℃,此時配合物隨溫度升高逐漸分解,樣品殘重率為20.09%(理論計算值19.01%),熱分解殘余物為CuO。

圖1 Cu(Ⅱ)配合物的TG-DTG曲線Fig.1 TG-DTG curves of the Cu(Ⅱ)

2.1.5 配合物可能的結構 通過以上分析推測配合物可能的結構如圖2所示。

圖2 Cu(Ⅱ)配合物可能的結構圖Fig.2 The suggested structure of the Cu(Ⅱ)complex

2.2 配合物與DNA相互作用的研究

2.2.1 紫外可見光譜研究 紫外可見光譜是研究小分子物質與核酸相互作用的最常用的技術,吸收曲線能否發生紅移以及紅移的程度是判斷小分子化合物能否與DNA發生插入作用的重要判據[14],配合物與DNA作用的紫外吸收光譜如圖3所示。

圖3 配合物在不同DNA濃度下的紫外-可見吸收光譜Fig.3 UV spectra of the comp lex upon various concentration of DNA

由圖3可以看出,隨著DNA濃度的增加配合物π-π*躍遷,在220～320 nm波長范圍內都發生了一定程度的紅移和減色效應,這可能是由于配體插入到DNA堿基之間,從而發生π電子的堆積,使配體π空軌道和堿基的π空軌道發生偶合,偶合后使能級下降,從而導致π-π*躍遷能減小,產生紅移現象;同時,偶合后的π*軌道因部分填充電子,使π-π*躍遷幾率減小,產生減色效應[15]。為了準確表達配合物與DNA相互作用的強度,可以根據公式求得兩者間的結合常數(Kb)。小分子化合物與DNA相互作用的結合常數與其紫外摩爾吸收系數之間符合以下公式:

公式中εa為任意DNA濃度下溶液的摩爾吸收系數,εf為自由配合物的摩爾吸收系數,εb是配合物被DNA完全鍵合時的摩爾吸收系數。由[DNA]/(εa-εf)對[DNA]作圖,得出斜率和截距,斜率和截距之比即結合常數(Kb)。結合常數的大小反映配合物與DNA間相互作用的強弱,計算結果為Kb=8.12×104L·mol-1,表明配合物與DNA的結合作用較強。

2.2.2 熒光光譜分析 熒光法是比較靈敏的測試方法,已廣泛應用于研究配合物與DNA的相互作用。

(1)配合物與DNA之間的作用為插入作用時,因為DNA具有疏水性且分子較大,DNA大分子的保護作用可以使配合物的熒光增強[16]。如圖4所示,DNA與配合物的濃度比值由1到7依次為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8,熒光強度依次增強,初步確定配合物與DNA之間的作用為插入作用。

圖4 配合物在不同DNA濃度下的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of the comp lex upon various concentration of DNA

圖5 Na+離子對配合物-DNA體系的相對熒光強度影響圖Fig.5 The relative fluo rescencent intensity of DNA-comp lex in various Na+concentration

(2)鹽類陽離子可與DNA骨架磷酸基團結合使DNA收縮而產生減色效應[17]。為確定配合物與DNA結合是否存在靜電結合模式,在隨Na+濃度增加的情況下,測定配合物-DNA復合體系,記錄熒光光譜圖,如圖5。結果表明,隨著Na+濃度的增加,體系的熒光沒有明顯變化,配合物與DNA之間不存在靜電引力作用,從而更加證明了配合物與DNA通過插入作用結合。(3)金屬配合物與DNA作用有多種機制,其中較多的有靜電結合模式和插入結合模式。由于DNA磷酸骨架帶有負電荷,對[Fe(CN)6]4-有強烈的排斥作用,若金屬陽離子以插入機理完全與DNA結合,配離子受保護強度大,被[Fe(CN)6]4-發光猝滅的可能性小,而以靜電機理結合的配陽離子裹附在DNA的表面,比較容易受到[Fe(CN)6]4-的進攻[17]。如圖6所示,加入DNA時曲線2與未加入DNA時曲線1后相比較,加入DNA后曲線2斜率約為0(線性回歸方程為y=-0.051 4 x+1.045 7),DNA對配離子產生保護作用,避免[Fe(CN)6]4-對配合物的熒光猝滅作用,進一步說明金屬陽離子以插入機理完全與DNA結合。

圖6 [Fe(CN)6]4-離子對配合物-DNA體系的相對熒光強度影響圖Fig.6 The relative fluo rescent intensity of DNA-comp lex in various concentration of[Fe(CN)6]4-

2.2.3 黏度分析研究 黏度測定被認為是在缺乏晶體數據的情況下確定鍵力模式最有力的證據之一[18]。黏度值對分子長度變化非常明顯,當配合物與DNA發生插入作用時,DNA鏈長會增加,相對黏度會增大;當配合物與DNA以靜電、溝槽結合等非插入方式結合時,DNA的黏度沒有明顯變化。如圖7所示,隨著配合物濃度的增加,黏度值相應增大,說明配合物以經典插入方式與DNA發生作用,這與紫外光譜研究及熒光光譜研究相吻合。

圖7 配合物濃度對DNA黏度的影響Fig.7 Effection of increasing amountsof comp lex on the viscosity of DNA

圖8 配合物與DNA作用的循環伏安圖Fig.8 The cyclic voltammograms of DNA-comp lex

2.2.4 電化學研究 在p H=7.2的緩沖溶液中測定了配合物及配合物-DNA體系的循環伏安曲線,通過對比2條曲線后峰電位移動情況,可以判斷配合物與DNA的作用方式,通常認為當小分子與DNA作用后峰電位負移,則結合方式為靜電結合,相反,如果小分子與DNA作用后峰電位正移,則結合方式為嵌插[19]。圖8中曲線1為合成的銅配合物在p H=7.2的緩沖溶液中的循環伏安圖,曲線2為加入DNA后的循環伏安圖。對比曲線1、2可知,加入DNA后,后峰電位由-0.102 V變為-0.083 V,發生了明顯的正移;峰電流由-14.33μA變為-13.41μA,峰電流明顯變小,這說明了配合物分子與DNA分子之間發生了鍵合作用,使得溶液中自由配合物分子的濃度減少,單位時間內遷移到電極表面的配合物分子數下降,導致峰電流減少,也說明了配合物與DNA之間形成的復合物為非電活性化合物[19],即該化合物不能在電極上發生氧化還原反應。通過以上分析可以斷定配合物與DNA發生了插入作用。

3 結語

本文合成了一種新的希夫堿銅配合物,通過元素分析、紅外光譜、紫外-可見光譜、TG-DTG及摩爾電導分析等手段對合成的配合物進行了表征,通過表征其組成為{[CuL(NO3)(C2H5OH)]·2H2O}。利用紫外光譜法、熒光光譜法、黏度法、電化學法研究了配合物與DNA的相互作用,結果表明Cu(Ⅱ)配合物與DNA以插入模式結合。

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Studies on the Synthesis,Characterization of the Schiff Base Comp lex Cu(Ⅱ)and the Interaction with DNA

ZHENG Yu-Ping,FAN Yu-Hua,ZHANG Xia,WANG Qiang,L IU Shan-Bin,B ICai-Feng
(The Key Labo rato ry of Marine Chemistry Theo ry and Technology,M inistry of Education,College of Chemistry and Chemi
cal Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266100,China)

This paper reports the synthesis of Cu(Ⅱ)comp lex{[CuL(NO3)(C2H5OH)]·2H2O}with ligand derived from the condensation of o-vanillin with 2-amino pyrimidine in the absolute alcohol.It is characterized by elemental analysis,IR spectrometry,UV-Vis spectrometry,TG-D TG and molar conductance.The suggested structure of the comp lex is concluded.The copper ion is six-coordinated with a octagonal geometry.The two nitrogen atom(one from the-C=N-,the other from the pyrimidine),oxygen atom of hydroxybenzene in ligand is coo rdinated to the copper ion.The nitric acid is coo rdinated to the copper ion in bidentate fashion,and the oxygen atom of C2H5OH is coo rdinated to the copper ions,too.Water molecules are existing as crystal water.The interaction of the Cu(Ⅱ)comp lex with DNA has been investigated by UV-Vis spectrometry,fluorescence spectrometry,viscosity and electrochemical behavior.The rusults show that the interaction of the Cu(Ⅱ)comp lex with DNA belong to intercalation mode,and the binding constant for the comp lex is Kb=8.12×104L·mol-1.

schiff base;Cu(Ⅱ)comp lex;synthesis;characterization;DNA;intercalation mode

O641.4

A

1672-5174(2011)09-077-06

國家自然科學基金項目(20971115;21071134)資助

2010-11-19;

2011-06-14

鄭玉萍(1984-),女,碩士生。E-mail:yuping8288@163.com

**通訊作者:E-mail:fanyh@ouc.edu.cn

責任編輯 徐 環