費約果葉片總黃酮提取工藝優化及其抗氧化活性研究

丁振柱, 黃仁華, 王 丹

(西南科技大學生命科學與工程學院,四川綿陽 621010)

費約果葉片總黃酮提取工藝優化及其抗氧化活性研究

丁振柱, 黃仁華＊, 王 丹

(西南科技大學生命科學與工程學院,四川綿陽 621010)

對費約果葉片總黃酮的提取工藝和抗氧化活性進行了研究。結果表明:費約果葉片總黃酮最佳提取工藝為溫度50℃、料液比1∶30(g∶mL)、提取時間50 min和甲醇體積分數70%。根據最佳提取工藝,重復3次得到總黃酮量分別46.89、44.51、48.27 mg/g,具有穩定性和可操作性;另外,通過半抑制濃度IC50衡量費約果葉片總黃酮提取物抗氧化活性,其抗脂質過氧化能力(IC500.275 mg/m L)和DPPH·自由基的清除能力(IC500.798 m g/m L)均優于抗壞血酸(IC500.643、IC500.917 mg/m L),而超氧陰離子自由基的清除能力(IC500.774 mg/m L)和羥自由基的清除能力(IC500.278 m g/m L)均弱于抗壞血酸(IC500.537、IC500.275 mg/m L)。

費約果;總黃酮;提取;抗氧化

費約果(Feijoa sellowianaBerg)系桃金娘科多年生亞熱帶常綠灌木果樹,原產于南美洲的巴西和烏拉圭,2004年由西南科技大學從新西蘭引種至我國四川綿陽地區[1],經過近幾年馴化引種研究,已逐步進入推廣種植階段。費約果葉片中含有大量的生物活性物質,包括維生素、黃酮、豆甾醇、β-胡蘿卜素、對羥基苯乙醇等等,是一種理想的綠色藥用資源[2]。本研究以費約果葉片為原料,采用正交試驗設計優化總黃酮提取工藝并分析提取物濃度與抗脂質過氧化、DPPH·、O2-·、·OH等自由基清除率的關系,為進一步推廣費約果的種植和發掘天然抗氧化活性成分以及提高費約果的經濟利用價值提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗用費約果葉片于2009年3月中旬采自西南科技大學西山校區費約果栽培園中。三吡啶三吖嗪(Tripyridyl triazine,TPTZ)、1,1-二苯基苦基苯阱(DPPH)及蘆丁購自 Sigma公司,其他藥品均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計 UV-1900:日本島津產品;臺式高速冷凍離心機:美國Beckman產品;KQ5200B型超聲波清洗機:旋轉蒸發器:上海亞榮生化儀器廠生產;恒溫水浴鍋:上海亞榮生化儀器廠生產;循環水式多用真空泵 SHB-ⅢS:鄭州長城科工貿有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 費約果葉片總黃酮提取工藝優化的正交試驗 影響植物組織類黃酮提取的因素很多,根據前人研究結果結合單因素實驗(實驗結果未列出),結果發現最主要的因素包括提取溫度、料液比、提取時間和甲醇體積分數,而且各因素之間存在著交互作用,據以此本實驗采用L9(34)進行正交試驗,以費約果葉片提取物中總黃酮的含量確定最佳提取工藝,試驗設計的影響因素及水平條件見表1所示。

1.3.2 費約果葉片總黃酮提取 根據 Kim的方法結合超聲波提取葉片中的總黃酮[3]。準確稱取新鮮費約果葉片1.0 g用于總黃酮的提取,將新鮮的樣品表面水分晾干后放在冰浴上研磨,直至研磨到沒有肉眼可見的塊狀葉片后將勻漿轉入離心管中,按照正交試驗設計進行超聲波提取,提取后4℃條件下4 000 r/m in離心10 m in收取上清液,轉移至50 m L蒸發瓶中,在40℃條件下旋轉蒸發提取液中的甲醇,直至蒸干。用4 m L重蒸去離子水溶解殘留物并轉移至10 mL離心管中,4℃條件下10 000 r/min離心10 m in,上清液貯存于-20℃冰箱中備用。

表1 費約果葉片總黃酮提取正交試驗因素設計Tab.1 Orthogonal experiment design for extracting flavonoids from Feijoa leaves

1.3.3 費約果葉片總黃酮含量測定 根據 Kim等方法測定總黃酮含量[3-4],取提取液0.1 mL放入10 m L試管中,接著加入1.9 m L重蒸去離子水混合均勻后,立即往試管中加入0.15 m L質量分數為5%NaNO2充分震蕩,5 min后加入0.15 mL質量分數為10%A lCl3反應1 m in后,加入1 m L 1 mol/L NaOH混合均勻,室溫放置反應3～5 min,當反應液顏色變至粉紅色,在510 nm條件下用分光光度計測定OD值。用蘆丁(Rutin)作標準曲線,葉片總黃酮含量用等量蘆丁表示。

1.3.4 抗脂質過氧化能力的測定 分別于樣品管中依次加入1 m L卵磷脂溶液(將300 mg卵磷脂溶于30 m L 10mmol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液的溶液中,冰浴振蕩)、1 m L 0.4 mmol/L硫酸亞鐵、1 m L樣品,混勻。避光于37℃水浴60 min,加入2 m L三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-HCl混合液(15 g TCA,0.37 g TBA,2.1 m L濃鹽酸依次放入100 m L水中),90～100℃水浴15 m in,迅速冷卻,以3 000 r/min離心10 min,取上清液在535nm測吸光度A1。空白管以1 m L重蒸水代替1 m L樣品,操作方法同樣品管,可測得空白管的吸光度A2,參比管中以1 m L重蒸水代替1 m L卵磷脂。根據其線性回歸方程求出吸光度為0.5時所需樣品的有效濃度(IC50),抗壞血酸為陽性對照[5]。

抑制率(%)=[(A2-A1)/A2]×100

1.3.5 對DPPH·自由基清除率的測定 準確移取不同濃度費約果葉片總黃酮提取液2 m L于10 m L試管中,加入 2 m L DPPH·溶液 (8 mg DPPH·用體積分數80%無水乙醇溶解并定容于100 m L棕色容量瓶),充分混勻,室溫靜置,30 m in后用分光光度計在517 nm下測定其吸光度A1(以體積分數80%無水乙醇溶液為參比);同時測定2 mL DPPH·溶液與2 mL體積分數80%無水乙醇溶液混合液的吸光度A2,以及不同濃度2 m L提取液與2m L 80%無水乙醇溶液混合液的吸光度A3。平行測定3次,取平均值后根據以下公式計算清除率。根據其線性回歸方程求出吸光度為0.5時所需樣品的有效濃度(IC50),抗壞血酸為陽性對照[6]。

清除率%=[1-(A1-A3)/A2]×100%

1.3.6 對超氧陰離子自由基清除率的測定 先將50 mmol/L Tris-HC1緩沖液(PH 8.2),3 mmol/L鄰苯三酚溶液(用10 mmol/LHC1配制),置25℃水浴預熱15 min。然后取 Tris-HC1緩沖液4.0 m L于試管中,加入不同濃度供試液 1.7 m L,3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL,以加入鄰苯三酚的瞬間開始計時,以水為空白,測定反應開始第100秒時,325 nm波長處吸光度A1。對照組A2使用無水乙醇代替供試液,對照組(A3)使用10 mmol/L HC1溶液代替鄰苯三酚溶液。每個濃度梯度平行測定3次,求平均值。并根據其線性回歸方程求出吸光度為0.5時所需樣品的有效濃度(IC50)。同時,以抗壞血酸作為陽性對照[7]。

清除率%=[A2-(A1-A3)]/A2×100%

1.3.7 對羥自由基清除率的測定取1 m L 9 mmol/L硫酸亞鐵與1 mL 10 mmol/L水楊酸于10 m L試管充分混合后,分別加入不同濃度費約果葉片總黃酮提取液1 mL,加1 m L過氧化氫(8.8 mmol/L)啟動反應,37℃反應30 min,以蒸餾水作參比,在510 nm下測吸光度A1。對照組A2用無水乙醇代替供試液。對照組A3用純凈水代替過氧化氫(8.8 mmol/L)。每個濃度梯度平行測定3次,求平均值。并根據其線性回歸方程求出吸光度為0.5時所需樣品的有效濃度(IC50),以抗壞血酸作為陽性對照[8]。

清除率%=[A2-(A1-A3)]/A2×100%

2 結果與分析

2.1 費約果葉片總黃酮提取正交試驗

以提取溫度、料液比、提取時間、甲醇濃度為因素的L9(34)正交試驗結果見表2所示,每個處理提取3次。從表中極差分析可以看出,提取溫度顯著影響著費約果葉片總黃酮的提取效果,表現最為明顯,其次為料液比,影響最小的因素為甲醇濃度,即各因素對費約果葉片總黃酮提取效果的主次順序為提取溫度>料液比>提取時間>甲醇體積分數,進一步分析可以發現提取工藝的最優方案為A1B1C2D2,即提取溫度50 ℃、料液比1∶30(g∶mL)、提取時間50 min和甲醇體積分數70%為最佳提取工藝組合。根據最佳提取工藝組合進行3次重復試驗,得到的費約果葉片總黃酮提取物量分別為:46.89mg/g、44.51mg/g、48.27 mg/g,均要高于正交表中所有試驗結果,且具有較好的重現性和可操作性。

表2 費約果葉片總黃酮提取正交試驗結果Tab.2 Results of orthogonal experiment for extracting total flavonoids from Feijoa leaves

2.2 費約果葉片總黃酮提取物抗氧化活性

費約果葉片總黃酮提取物對 Fe2+引發的卵磷脂脂質體過氧化的抑制作用見圖3(a)所示,當總黃酮提取物質量濃度為0.2 mg/mL時,抑制率為43%,質量濃度為0.4 mg/m L時抑制率為69%,再增加提取物質量濃度,抑制率增長緩慢。用半抑制濃度IC50衡量,費約果葉片總黃酮提取物抗脂質過氧化能力(IC500.275 mg/m L)要顯著優于抗壞血酸(IC500.643 mg/mL)。

圖3(b)反映了費約果葉片總黃酮提取物清除DPPH·能力與濃度的變化關系,從圖中可以看出,隨著提取產物總黃酮質量濃度的增加,DPPH·的清除率也隨之增加,且在低濃度范圍內(0.5～1.0 mg/mL)增長較快。另外,質量濃度為0.5 mg/m L時,費約果葉片總黃酮提取物對DPPH·的清除率與抗壞血酸相當,而較高質量濃度下費約果葉片總黃酮提取物對DPPH·的清除率高于抗壞血酸。用半抑制濃度IC50衡量,費約果葉片總黃酮提取物對DPPH·的清除能力(IC500.798 mg/m L)要優于抗壞血酸(IC500.917 mg/m L)。

圖1 費約果葉片總黃酮不同濃度提取物抗脂質能力(a)、清除DPPH·能力(b)、清除O2-·(c)和清除·OH(d)能力Fig.1 Capability of total flavonoids with various concentrations from Feijao leaves on inhibiting lipid peroxidation,scavenging DPPH.,O2-·and ·OH

從圖3(c)和圖3(d)中可以看出,費約果葉片總黃酮提取物對超氧陰離子(O2-·和羥自由基(·OH)的清除率均隨著濃度的增加而增強。但在相同濃度條件下,費約果葉片總黃酮提取物對超氧自由基和羥自由基清除率均顯著低于抗壞血酸。用半抑制濃度IC50衡量,費約果葉片總黃酮提取物對超氧陰離子自由基的清除能力(IC500.774 mg/m L)和對羥自由基的清除率(IC500.278 mg/m L)均要弱于抗壞血酸(IC500.537 mg/m L)和(IC500.064 m g/m L)。

3 結 語

通過對費約果葉片總黃酮提取工藝的單因素試驗(預實驗結果未列出)和正交試驗分析,確定了費約果葉片總黃酮提取的最佳工藝為提取溫度50℃、料液比1∶30(g∶m L)、提取時間50 m in和甲醇體積分數70%。

抗氧化活性實驗結果顯示,費約果葉片總黃酮提取物對脂質過氧化具有較強的抑制效果,且顯著高于抗壞血酸,其原因可能是費約果葉片中黃酮提取成分中具有能螯合鐵離子的有效物質,表現出了較強的抗脂質過氧化[9];另一方面,費約果葉片總黃酮提取物在清除O2-·、·OH等離子方面要弱于抗壞血酸,可能與黃酮有效成分的結構有關,有待進一步研究。

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Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activities of the Total Flavonoids from Feijoa sellowiana Leaves

DING Zhen-zhu, HUANG Ren-hua＊, WANG Dan

(College of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621002,China)

This manuscript optimized the extraction technologies and investigated the antioxidant activities of the total flavonoids fromFeijoa sellowianaleaves.The results determined that the optimum parameters of extraction process as follow s:the extraction temperature 40℃,the ratio of sample to extraction solution 1:30,the extraction time 50 min and the concentration methyl alcohol 70%.With the optimum extraction parameters,the total flavonoids contents with three reiterations achieved at 46.89 mg/gFW,44.51 mg/gFW and 48.27mg/gFW,respectively.In addition,half-inhibitory concentration IC50 was used to evaluate antioxidant activities of total flavonoids from Feijoa leaves.The capability of inhibiting lipid peroxidation(IC500.275 mg/mL)and scavenging effects on DPPH freedom radical(IC500.798 mg/m L)of to talflavonoids extracts were stronger than the co rresponding values of ascorbic acid(IC500.643 mg/m L and IC500.917 mg/m L).However,the scavenging effects on superoxide anion(IC500.774 mg/m L)and hydroxyl freedom radical(IC500.278 mg/mL)were weaker than that of ascorbic acid(IC500.537 mg/m L and IC500.275 mg/m L).

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Feijoa sellowiana,total flavonoids,extraction technology,antioxidant activities

TS 201.2

A

1673-1689(2011)03-0371-05

2010-05-20

四川省科技廳重點項目(07zs2106);西南科技大學博士基金項目(08zx7104)。

＊

黃仁華(1979-),男,湖北鐘祥人,農學博士,副教授,主要從事植物化學成分結構與功能開發方面的研究。Email:huangrenhua@sw ust.edu.cn

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