EIAV強毒株和疫苗株gp45的純化及結晶比較

王建新，王 敏，劉新奇

(1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 南開大學生命科學學院，天津 300071)

EIAV強毒株和疫苗株gp45的純化及結晶比較

王建新1，王 敏1，劉新奇2

(1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 南開大學生命科學學院，天津 300071)

EIAV(equine infectious anemia virus)疫苗是世界唯一成功的慢病毒疫苗.通過對強毒株和疫苗株EIAV相關蛋白結構的比較研究，可以促進對其致弱過程及免疫機制的了解.gp45(glycoprotein 45)是EIAV介導與宿主膜融合過程的關鍵蛋白.以EIAV強毒株LN40和疫苗株FDDV13為研究對象，對gp,45核心結構域進行了克隆、表達，并對純化和晶體生長進行了比較，為進一步的三維結構解析，更好地理解 EIAV減毒疫苗的免疫機制及相關疫苗設計奠定了基礎.

EIAV；強毒株；疫苗株；gp45；結晶

EIAV(equine infectious anemia virus)與HIV(human immunodeficiency virus)同為慢病毒，兩者在病毒形態、基因組結構、細胞嗜性、病毒復制的分子機制、病毒的生活周期、抗原漂移規律、免疫機制及病毒與宿主相互作用等方面都極為相似.深入探索EIAV減毒疫苗相關的免疫保護機制，將為HIV的新型疫苗的研究提供借鑒.

EIAV的gp45(glycoprotein 45)與HIV-1的gp41(glycoprotein 41)跨膜蛋白在介導病毒與靶細胞之間的融膜過程中起關鍵作用.位于gp45融合區和穿錨區之間的氨基酸肽段的抗原性很強，是跨膜蛋白的主要免疫區，被稱為核心結構域.該區域在EIAV疫苗誘導馬體的免疫應答以及EIA診斷中具有重要作用[1].通過對強毒株和疫苗株該區域的結構研究，可以了解EIAV病毒致弱過程中gp45結構變異、進化的關系，有助于更好地理解EIAV病毒的致病機制和EIAV疫苗的作用機理，為其他慢病毒屬疫苗尤其是 HIV疫苗的合理設計提供結構依據.目前尚無關于 EIAV gp45晶體結構的報道.本研究參考最早報道的 HIV gp41核心結構域晶體[2]的截短設計，對EIAV強毒株LN40和疫苗株 FDDV13核心結構域進行了原核表達和純化，并對其結晶行為進行了探索.

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達載體 pET30-his、表達菌株 E. coli Rosetta(DE3)及 EIAV gp140質粒由本實驗室保存；感受態細胞E. coli TOP10，北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶和 DNA聚合酶，TaKaRa公司；質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒，北京天根生化科技有限公司；引物由北京華大基因公司合成；其余試劑均為國產分析純.

1.2 方法

1.2.1 構建gp45重組質粒

本實驗以EIAV gp140質粒為模板，采用Overlap PCR對 gp45目的片段進行擴增，去除中間的 DSL區.對擴增片段用T4聚合酶處理，與載體pET30-his用 LIC法進行連接.重組質粒經限制性內切酶酶切和DNA測序驗證.

1.2.2 gp45蛋白的誘導表達及純化

重組的pET30,gp45-his質粒轉到E. coli Rosetta(DE3)細菌中，37,℃搖菌至 A600為 0.6～0.8，加入IPTG至終濃度0.2,mmol/L，并在25,℃下進行過夜誘導表達.收集菌體后用平衡液 0.05,mol/L,Tris-HCl，pH,8.0，0.5 mol/L,NaCl)重懸，超聲破碎，18,000,r/min離心 30,min除去細胞碎片和不溶物.將上清液與預先用平衡液平衡過的鎳離子偶聯瓊脂糖介質(Ni-NTA，Qiagen公司)混合，再用漂洗液(0.05,mol/L Tris-HCl，pH,8.0，0.5,mol/L,NaCl，0.02,mol/L 咪唑)充分除去雜蛋白，然后用洗脫液(0.05,mol/L,Tris-HCl，pH,8.0，0.5,mol/L,NaCl，0.5,mol/L 咪唑)洗脫目的蛋白.將洗脫的目的蛋白經過 Hitrap Q(GE Healthcare公司)離子交換層析和 Superdex 200(GE Healthcare公司)凝膠過濾層析進一步純化.

1.2.3 gp45蛋白的結晶及結晶條件優化

將純化后的gp45蛋白濃縮到10,mg/mL，采用坐滴氣相擴散法，以商品化的結晶條件試劑盒為池液，在 20,℃恒溫條件下進行結晶條件篩選.對初篩得到微晶的結晶條件進行拉梯度細分，采用懸滴氣相擴散法手工配制溶液，對晶體進行優化.

2 結果與分析

2.1 強毒株和疫苗株gp45核心結構域保守性分析

強毒株與疫苗株 gp45序列比對(圖 1)結果顯示，強毒株 LN40和疫苗株 FDDV13核心結構域中有4個氨基酸的差異(方框部分).

圖1 強毒株與疫苗株gp45序列比對Fig.1 Sequence alignment of virulent strain and vaccine strain of gp45

2.2 gp45蛋白的純化

對于強毒株 gp45蛋白，先經過鎳柱親和層析，然后將洗脫下來的目的蛋白濃縮后進行離子交換層析和凝膠過濾層析.對于疫苗株 gp45蛋白，先經過鎳柱親和層析，將洗脫下來的目的蛋白用 TEV酶在16,℃處理過夜，然后進行離子交換層析和凝膠過濾層析，如圖2—圖5所示.gp45凝膠過濾層析純化后SDS-PAGE分析見圖6.

圖 3和圖 5中主峰單一，峰型對稱，表明 gp45蛋白以均一的三聚體形式存在.

圖2 gp45-his＋離子交換層析圖譜Fig.2 Ion exchange chromatography of gp45-his+

圖3 gp45-his+凝膠過濾層析圖譜Fig.3 Gel filtration chromatography of gp45-his+

圖4 gp45-his-離子交換層析圖譜Fig.4 Ion exchange chromatography of gp45-his-

圖5 gp45-his-凝膠過濾層析圖譜Fig.5 Gel filtration chromatography of gp45-his-

圖6 gp45凝膠過濾層析純化后SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of gp45 after gel filtration chromatography

圖6中，左泳道為強毒株gp45帶his標簽樣品，右泳道為強毒株 gp45切 his標簽樣品.兩條帶均在1.4×104上下，與預期相對分子質量相符，且條帶單一，純度較好，達到晶體篩選要求.

2.3 gp45的晶體生長與優化

經坐滴法篩選，強毒株 gp45在多種條件(表 1)下均能長出微晶(圖 7(a)).在此系列結晶條件基礎上進行優化，最終在條件 0.2,mol/L 氯化鎂，0.1,mol/L BisTris pH 5.5，25% PEG3350中挑出晶體進行X射線衍射及數據收集，衍射分辨率達到0.28,nm(圖8).

對于疫苗株 gp45，在條件 0.2,mol/L氯化鈣，0.1,mol/L醋酸鈉 pH 4.6，20%異丙醇中同樣獲得了微晶(圖7(b)).目前還未得到適于數據收集的晶體.

表1 強毒株gp45初篩結晶條件Tab.1 Virulent strain gp45 crystallization conditions of preliminary screen

圖7 gp45晶體顯微照片Fig.7 Crystal photomicrograph of gp45

圖8 強毒株gp45蛋白晶體衍射圖Fig.8 Diffraction map of virulent gp45 crystal

3 討 論

EIAV疫苗株FDDV和另外一個疫苗株DLV在Env區的 10個一致性突變位點中，有 9個定位在gp90區，一個在gp45區[3].強毒株和疫苗株gp45核心結構域氨基酸序列只相差4個氨基酸(圖1).表明gp45區在進化上是比較保守的，這也許能成為EIAV良好的靶位點，開發針對性的疫苗和中和性抗體.

強毒株和疫苗株gp45在離子交換層析和凝膠過濾層析中行為相似(圖 2—圖 5)，但在結晶行為上有明顯差異.晶體初篩結果表明：強毒株 gp45在切除和不切除 his標簽時均能長出晶體，而且不切除標簽時晶體質量更好；疫苗株 gp45只有在切除 his標簽的情況下才能長出晶體，并且結晶條件也與強毒株有較大差異.這些結果表明，his標簽很有可能促進了強毒株 gp45的結晶而阻礙了疫苗株 gp45的結晶.強毒株和疫苗株 gp45晶體外形都是六方的，提示這兩種蛋白很有可能具有相同的空間群.

強毒株gp45晶體衍射分辨率達到了0.28,nm，但由于數據質量問題，無法解析出其準確的三維空間結構，其晶體還需進一步優化.疫苗株 gp45晶體由于個體較小無法進行數據收集，其優化工作仍將繼續.

HIV侵入人體后，宿主的免疫反應主要是針對HIV的表面糖蛋白 Env產生的.所以近年來國際上針對Env編碼的兩個糖蛋白gp120和gp41展開了大量的研究工作，并在結構研究方面取得了許多重要的進展[4-13]，解析出了一系列的關于 gp120和 gp41的晶體結構.但是，缺乏動物模型和對HIV感染的保護性免疫機制知之甚少一直是 HIV疫苗研究的最大障礙[5].EIAV 減毒疫苗是迄今為止在世界上唯一大規模應用的慢病毒疫苗，但是該疫苗的免疫保護機制尚未完全闡明[6].目前以 EIAV減毒疫苗為基礎的新型HIV疫苗的抗原改造研究正在進行中，通過對中國EIAV減毒疫苗的減弱機制以及保護性免疫的深入研究，將會對包括 HIV在內的其他慢病毒疫苗研究提供更多的科學借鑒.

我國艾滋病疫情嚴重，研制安全有效的艾滋病疫苗刻不容緩.我國在 HIV方面的研究滯后于國際先進水平，但是我國擁有世界上唯一成功的慢病毒疫苗.以此疫苗為基礎進行免疫機制研究，可以較好地指導 HIV疫苗的設計開發工作.目前，對于 EIAV Env相關蛋白的結構信息一無所知，通過對EIAV強毒株和疫苗株蛋白結構方面更深入的研究，可以緊緊抓住慢病毒疫苗這一優勢，更好地理解 EIAV病毒進化的策略及疫苗的免疫保護機制，更能以此為基礎，為更合理的設計EIAV以及HIV疫苗和相關藥物提供強有力的參考.

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Purification and Crystallization Comparison between EIAV gp45 of Virulent Strain and Vaccine Strain

WANG Jian-xin1，WANG Min1，LIU Xin-qi2
(1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. College of Life Sciences，Nankai University，Tianjin 300071，China)

EIAV(equine infectious anemia virus)vaccine is the only successful lentivirus vaccine in the world. By comparison studies of EIAV virulent strain and vaccine strain related protein structures，better realization of the attenuation process and immune mechanism can be achieved. The gp45(glycoprotein 45)is a key protein in mediating membrane fusion between EIAV and host cell. Taking EIAV virulent strain LN40 and vaccine strain FDDV13 as research subjects，the core structure of virulent strain and vaccine strain gp45 was cloned，expressed，and purification and crystallization characters were compared，which laid the foundation for further resolution of the three dimensional structure，better understanding of immune mechanism of EIAV attenuated vaccine and related vaccine design.

EIAV；virulent strain；vaccine strain；gp45；crystallization

Q518.2

A

1672-6510(2011)04-0010-04

2011–02–18；

2011–03–11

國家973計劃項目資助(2010CB911800)；“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”專項(2008ZX10001-010)

王建新（1985—），男，河南人，碩士研究生；通信作者：劉新奇，教授，liu2008@naikai.edu.cn.