TMPRSS4和onfFN在甲狀腺細針吸標本中的定量表達

姚曉峰 張 侖 張 強 曹曉莉

細針吸細胞學檢查(FNAB)是甲狀腺癌診斷和鑒別診斷的常用方法，它操作簡單、安全、快捷，并且具有較高的特異性和準確率。但是，FNAB也有一定的局限性和缺陷，由于細胞結構特點不明顯或取材不當而導致無法明確診斷，在臨床應用中受到一定的限制。本實驗應用熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)，檢測甲狀腺細針吸組織中TMPRSS4和onfFN mRNA的表達量，并探討其與FNAB聯合對甲狀腺癌診斷和鑒別診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

收集天津醫科大學附屬腫瘤醫院2006年1月至2007年7月。甲狀腺細針吸標本78例，其中術后病理檢查證實為甲狀腺癌45例，其中乳頭狀癌29例，濾泡癌9例，髓樣癌5例，未分化癌2例；男性18例，女性27例，年齡8～79歲，平均年齡48.5歲。甲狀腺良性病變33例，其中結節性甲狀腺腫16例，腺瘤13例，橋本氏甲狀腺炎4例；男性13例，女性20例，年齡16～72歲，平均年齡44歲。所有病例均行超聲引導下的細針吸細胞學檢查，其中一部分標本用于涂片后細胞學檢測，另一部分放入裝有TRIzol試劑試管內，然后在-80℃的冰箱內凍存。

1.2 熒光定量RT-PCR

TRIzol法提取甲狀腺細針吸標本的RNA，微量核酸檢測儀測定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳判斷提取RNA的質量。引物與探針的設計采用Oligo 6.0軟件。TMPRSS4的引物和探針：Forward5′- CTG，CCT，TGG，GGT，GAC，AAT，CT-3′，Reverse5′- CAT，CGA，GGC，TGT，TCA，GAG，GTT-3′，Probe5′(FAM)- GGG，AGG，ATC，ACA，GAG，CCA，GCA，TGT，T-3′(TAMRA)。onfFN的引物和探針：Forward5′- GAG，GTG，CCA，CCT，ACA，ACA，TCA，TA -3′，Reverse5′- AGG，GGT，CAA，AGC，ACG，AGT，CAT-3′，Probe5′(FAM)- ACC，GTG，GGC，AAC，TCT，GTC，AAC，GAA，G -3′(TAMRA)。GAPDH的引物和探針：Forward5′- GAA，GGT，GAA，GGT，CGG，AGT，C -3′，Reverse5′- GAA，GAT，GGT，GAT，GGG，ATT，TC-3′，Probe5′(FAM)- CAA，GCT，TCC，CGT，TCT，CAG，CC -3′(TAMRA)。引物和探針均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。實驗步驟按照試劑盒(Invitrogen)說明書進行。熒光定量RT-PCR結果的計算：目的基因的標準值=2-(目的基因的Ct值-GAPDH的Ct值)，Ct值表示PCR循環閾值。

1.3 統計學方法

所用數據均采用SPSS13.0 for windows 統計軟件處理，良惡性腫瘤的比較采用t檢驗， TMPRSS4與onfFN的相關性采用線性相關檢驗。

2 結果

2.1 TMPRSS4、onfFN的表達情況

RT-PCR結果顯示：甲狀腺癌和甲狀腺良性病變組織中TMPRSS4和onfFN mRNA的平均表達量分別為15.236±9.685、0.569±0.374和25.318±15.642、0.865±0.219，惡性與良性組織中兩者表達差異均有統計學意義(P均=0.000)，2種分子標志物在甲狀腺癌組織中的表達呈正相關性(γ=0.374,P=0.026)。

2.2 TMPRSS4和onfFN mRNA表達與甲狀腺癌臨床病理參數的關系

由表1可見， TMPRSS4 mRNA和onfFN mRNA的表達與患者性別、年齡、腫瘤大小無相關性，而與淋巴結轉移和TNM分期顯著相關(P=0.009、P=0.015和P=0.024、P=0.08)。

表1 OnfFN和TMPRSS4表達與甲狀腺癌臨床病理參數的關系

3 討論

TMPRSS4功能上具有胰酶活性，可能在腫瘤的轉移和浸潤過程中起重要作用，除了胰腺癌在其它惡性腫瘤中TMPRSS4表達水平也提高，例如胃癌、結腸癌和直腸癌等，在軟組織肉瘤和乳腺癌中不表達，在正常的心、腦、肺、肝、骨骼肌、胎盤、子宮和脂肪組織中不表達，而在正常消化道和泌尿生殖道中微量表達。由此可見，TMPRSS4表達存在著組織特異性和腫瘤特異性，并且這種表達的提高不出現在炎癥組織中，這些都表明它與腫瘤有著密切的關系[1]。關于TMPRSS4在甲狀腺癌中的表達情況研究的很少，Electron Kebebew等[2]通過cDNA微陣列技術篩選出差異表達基因TMPRSS4，并經過定量RT-PCR驗證發現，它在甲狀腺癌中的高度表達，尤其是在濾泡樣癌和乳頭狀癌濾泡亞型中高度表達，但表達水平與原發腫瘤大小及淋巴結是否轉移無關。本實驗研究結果顯示：TMPRSS4 mRNA在甲狀腺癌中的表達量高于甲狀腺良性腫瘤， TMPRSS4表達與腫瘤患者性別、年齡及腫瘤大小無關，而與淋巴結是否轉和TNM分期有關，在有淋巴結轉移和TNM Ⅲ+Ⅳ期的標本中的表達水平要高于無淋巴結轉移和TNMⅠ+Ⅱ期的組織，說明TMPRSS4在甲狀腺癌的轉移和進展過程中可能起到了至關重要的作用。

癌胚纖維連接蛋白(onfFN)是1個相對分子量為(310～335)×103的糖蛋白，正常情況下由子宮內皮下的滋養層細胞和胚胎細胞分泌，作為胎盤的生物膠存在，在妊娠早期存在，而37周以后就會減少[3]。病理情況下在某些腫瘤組織細胞中高度表達，而在正常成人組織中不表達或微量表達，不同的腫瘤組織中表達也存在著明顯的差異，與腫瘤的侵襲和轉移關系密切。很多研究表明，onfFN在多種惡性腫瘤中高度表達，例如在肺癌、子宮等[4，5]中都有表達。在甲狀腺癌中它的表達水平同樣升高，E Hesse等[6]應用cDNA微陣列技術，篩選出甲狀腺癌中onfFN的表達存在差異，應用RT-PCR也證實了這一差異，發現在甲狀腺乳頭狀癌(PTC)中陽性率為98％，在甲狀腺濾泡癌(FTC)陽性率為78％。同時，監測了外周血中正常細胞的表達情況，發現在正常的血細胞中無onfFN表達，這些說明通過檢測外周血中onfFN的表達可以用于甲狀腺微小轉移的監測，將腫瘤組織的殘留降到最低，同時還可以用于評估惡性腫瘤治療方案的效果。本實驗結果表明，onfFN mRNA在甲狀腺癌中的表達量要高于良性甲狀腺病變，同時，onfFN表達與腫瘤患者性別、年齡、腫瘤大小無關，而與患者有無淋巴結轉移及TNM分期相關，有淋巴結轉移和TNM Ⅲ+Ⅳ期標本中onfFN表達要高于無淋巴結轉移和TNMⅠ+Ⅱ期組織，并且onfFN與TMPRSS4在甲狀腺癌中的表達呈正相關，說明onfFN與TMPRSS4一樣可能在甲狀腺癌的進展和轉移過程中起到一定的作用，而且在此過程中兩者起到了協同作用。

隨著現代分子生物學技術的不斷發展，對甲狀腺癌分子標志物的研究會越來越深入，相信它在臨床的應用前景非常廣闊，尤其是與細針吸細胞學檢查聯合后，對甲狀腺病變的術前診斷和鑒別診斷具有很高的臨床實用價值，為臨床制定治療方案提供準確的信息。

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[2]Electron Kebebew MD,Miao Peng MD.ECM1 and TMPRSS4 are diagnostic markers of malignant thyroid neoplasms and improve the accuracy of fine needle aspiration biopsy〔J〕.Annals of Surgery,2005,242(3):353.

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[4]Nanki N,Fujita J,Yang Y,et al.Expression of oncofetal fibronectin and syndecan-1 mRNA in 18 human lung cancer cell lines〔J〕.Tumour Biol,2001,22(6):390.

[5]Menzin AW,Loret de Mola JR,Bilker WB,et al.Identification of oncofetal fibronectin in patients with advanced epithelial ovarian cancer:detection in ascitic fluid and localization to primary sites and metastatic implants〔J〕.Cancer,1998,82(1):152.

[6]E Hesse,PB Musholt,E Potter，et al.Oncofoetal fibronectin-a tumour-specific marker in detecting minimal residual disease in differentiated thyroid carcinoma〔J〕.British Journal of Cancer ,2005,93:565.