粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶(ACC)基因的克隆及CT功能域基因的原核表達

李潔瓊，王利兵，劉陽，鄭世學，喻子牛

(華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室微生物農藥國家工程研究中心，湖北武漢430070)

乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)是催化脂肪酸合成第一步反應的關鍵酶和限速酶，主要催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰單酰輔酶A。在大多數原核生物中，該酶屬于異質性［1］，由4個單獨的亞基組成，分別為生物素羧化酶(biotin carboxylase，BC)、生物素羧基載體蛋白(biotin carboxyl carrier protein，BCCP)和羧基轉移酶(carboxyltransferase，α-CT和β-CT)。在ACC催化乙酰輔酶A羧化反應的過程中，BC、CT各催化2個獨立的半反應，BCCP作為活化羧基的供體，在BC和CT間傳遞羧基，反應如下:首先，在ATP供能、Mg2+存在下，BC催化BCCP連上一個活化的羧基，緊接著在CT的作用下將BCCP上的羧基轉移到乙酰輔酶A上生成丙二酰單酰輔酶A。在大多數真核生物中該酶由1條帶有相應功能域的多肽鏈編碼，即同質型ACC［2］。在油料作物研究中，ACC作為脂肪酸合成的限速酶，成為研究熱點。由于高等植物的油脂代謝途徑中的同功異構酶、調控因子和遺傳操作的復雜性，從高等植物中克隆和鑒定基因要比微生物來源的困難得多，目前在轉基因植物中使用的大多數基因均來自微生物，因此從微生物中克隆和鑒定油脂合成和調控的關鍵基因就成為關注的熱點。Meng等［3］從細菌Acinetobacter calcoaceticus中克隆了ACC的4個亞基編碼基因并在大腸埃希菌中實現共表達，重組菌株的脂肪酸含量較野生型提高了5.6倍。Ruenwai等［4］成功克隆了真菌Mucor rouxii的ACC基因，將其轉化到非油脂酵母Hansenula polymorpha中，總油脂含量提高了40%。粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)是一種油脂酵母，油脂含量超過70%，其ACC理論上屬于同質型，應帶有BC、BCCP和CT 3個典型的功能域，其氨基酸序列和基因序列均未在GenBank上檢索到。本研究目的是利用分子克隆技術獲取粘紅酵母ACC的基因序列，以期為轉基因油料作物提供新的基因來源。由于在禾本科植物中ACC的CT功能域被證實是幾類化學除草劑作用的靶蛋白［5］，而酵母ACCase CT功能域與禾本科植物質體ACCase CT功能域具有較高的同源性，本文將對粘紅酵母ACC的CT功能域進行原核表達，希望為進一步探尋CT與除草劑的作用機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)，編號31596，由中國農業科學院油料作物研究所提供;大腸埃希菌(Escherichia coli)DH5α、表達菌株BL21(DE3)、表達載體pET28a由本實驗室保存;質粒載體PMD-18T購自TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑GenomeWalker Universal kit、Ex TaqTMPolymerase、LA TaqTMPolymerase和RNase A、限制性內切酶購自TaKaRa公司，E.Z.N.A.TMYeast RNA Kit和E.Z.N.A.TMYeast DNA Kit購自Omega公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit、T4 DNA連接酶購自Fermentas公司，AxyPrepTMDNAGelExtractionKit和AxyPrepTMPCR Cleanup Kit均購自AXYGEN公司，HisTrap FF1毫升柱購自通用電氣醫療集團。

1.1.3 培養基粘紅酵母采用YPD培養基活化培養，大腸埃希菌采用LB培養基培養，抗性篩選時加入卡那霉素(Kan)，終濃度為50 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 粘紅酵母基因組DNA及總RNA的提取

粘紅酵母基因組DNA及總RNA的提取方法分別參見Omega公司E.Z.N.A.TMYeast DNA Kit和E.Z.N.A.TMYeast RNA Kit說明書。

1.2.2 簡并PCR擴增粘紅酵母ACC基因的部分序列［6］在KEGG數據庫中下載不同種類酵母和絲狀真菌的乙酰輔酶A羧化酶氨基酸序列，進行多序列比對后，選取3個保守區域IANNGIA、QKIIEEA、WGYFSV設計了2對簡并引物INF/FY-R、QK-F/WG-R(引物序列見表1)進行PCR擴增。PCR體系如下(50 μL):基因組DNA 1 μL，10×Ex TaqTMbuffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，Ex TaqTM酶0.5 μL(5 U/μL)，ddH2O 37.5 μL。采用降落PCR程序:94℃預變性5 min;其后94℃30 s，51℃45 s，72℃1 min，每經過1個循環溫度降低0.5℃，11個循環;然后94℃30 s，46℃45 s，72℃1 min，19個循環;最后72℃延伸10 min。將上述PCR產物分別克隆到載體PMD-18T上，轉化DH5α感受態。菌落PCR驗證，挑取陽性克隆子進行測序分析。

1.2.3 染色體步移法擴增粘紅酵母ACC基因全長［7］保守序列的5'端染色體步移:根據上面獲得的部分序列的測序結果設計2條特異性引物GW5-1、GW5-2，結合Genomewalker universal kit中的2條接頭引物AP1、AP2，分別組成2對引物GW5-1/AP1、GW5-2/AP2，進行巢式PCR擴增。具體操作如下:①抽提并純化目標物種的基因組DNA，見OMEGA酵母DNA提取試劑盒說明書;②分別用4種平末端酶(EcoRⅤ、PvuⅡ、DraⅠ、StuⅠ)消化基因組DNA并純化;③給4種消化好的基因組DNA加上接頭Adaptor，構建成Genome walking酶切文庫;④以適當稀釋的Genome walking文庫DNA為模板，用引物AP1和GW5-1進行首輪PCR;⑤再以適當稀釋的首輪PCR產物為模板，用引物AP2和GW5-2進行次輪的巢式PCR;⑥瓊脂糖電泳回收適當大小的特異性巢式PCR產物，測序驗證。

保守序列的3'端染色體步移方法同上。在染色體步移中使用到的引物見表1。

表1 粘紅酵母ACC基因克隆工作中使用的引物Table 1 Primers used in the work of ACC gene clone from Rhodotorula glutinis

1.2.4 RT-PCR擴增ACC CT功能域基因參照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明書的步驟進行反轉錄PCR，合成cDNA第一鏈，再用特異性引物對NH-3-E-F/NH-3-H-R克隆CT cDNA，引物序列如下NH-3-E-F:CG GAATTC CCCGAGTACCCTCGAG;NH-3-H-R:CCC AAGCTT AGCATCCTTCCACACAAG，其中NH-3-E-F帶有限制性內切酶EcoRⅠ的識別序列，NH-3-H-R帶有限制性內切酶HindⅢ的識別序列，見劃線的序列。將擴增得到的目的片段克隆到PMD-18T上轉化DH5α感受態，用菌落PCR篩選陽性轉化子后送往華大基因有限公司進一步測序驗證。

1.2.5 CT功能域基因原核表達載體的構建［8］抽提上述測序驗證正確的陽性轉化子的質粒PMD-18T-CT，用限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ進行雙酶切，純化回收目的片段CT，連接到用相同限制性內切酶進行酶切的pET-28a載體中，連接產物轉化DH5α感受態。用同上的方法篩選陽性轉化子。

1.2.6 工程菌株目的蛋白的誘導表達及純化［9］

將驗證正確的重組表達載體pET-28a-CT轉入BL21(DE3)感受態細胞中，50 μg/mL Kan篩選陽性克隆子，獲得含目的基因的工程菌株。工程菌株在LB液體培養基中培養至OD600=0.6時，加入0.1 mmol/L IPTG開始誘導表達。25℃過夜培養16 h，收集菌體。通過SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達情況。表達獲得的粗蛋白用Ni-NTA樹脂柱純化。

2 結果與分析

2.1 粘紅酵母ACC基因部分序列的克隆及序列分析

以提取的粘紅酵母基因組DNA為模板，利用簡并引物QK-F/WG-R及IN-F/FY-R進行PCR擴增，獲得2條DNA產物長度分別為500 bp(圖1A)、808 bp(圖1B)，測序分析正確后將上述獲得的2個片段進行序列拼接，得到總長為1 286 bp的DNA序列，命名為NH-IW。

圖1 簡并PCR擴增粘紅酵母ACC基因部分序列的結果Fig.1 The result of cloning partial sequence of ACC gene from Rhodotorula glutinis by degenerate PCR

A:利用引物對QK-F/WG-R進行PCR擴增的結果;B:利用引物對IN-F/FY-R進行PCR擴增的結果;M:DL2000 Marker

A:The result of PCR amplification using primers QK-F/WG-R;B:The result of PCR amplification using primers INF/FY-R;M:DL2000 Marker

將該序列提交到BlastX上進行同源比對，結果顯示GenBank上沒有登錄上述獲得的粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因的部分序列。由該序列推導的氨基酸序列與Aspergillus nidulan FGSC A4菌株乙酰輔酶A羧化酶的相似性達到88%。因此證明獲得的基因片段為粘紅酵母乙酰輔酶A羧化酶基因部分序列，可用于下一步的染色體步移實驗。

2.2 染色體步移法克隆粘紅酵母ACC基因全長

在上述已獲得片段NH-IW的基礎上，利用染色體步移法擴增獲得其5'端序列和3'端序列，凝膠電泳結果如圖2所示。通過測序，染色體步移獲得的所有片段均是正確的。最終，從DNA水平上拼接獲得了總長為7.27 kb的片段。通過生物信息學分析，其中含有2個內含子，分別位于42～147 bp和315～677 bp處，編碼區域總長為6 801 bp。在NCBI上對該序列對應的氨基酸序列的保守區域進行分析，發現它具有乙酰輔酶A羧化酶典型的3個功能域BC、BCCP和CT。將該序列提交到BlastX上進行同源比對，結果顯示由該序列推導的氨基酸序列與Yarrowia lipolytica YALI0C11407p的乙酰輔酶A羧化酶的相似度到達98%。

圖2 序列NH-IW上下游的染色體步移結果Fig.2 The result of genome walking of upstream and downstream of the partial sequence NH-IW

2.3 粘紅酵母ACC CT功能域基因的克隆

按照E.Z.N.A.TMYeast RNA Kit說明抽提得到粘紅酵母RNA，進行快速瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖3A，28S RNA、18S RNA、5S RNA 3條帶均可以看見，測定所得RNA在A260/A280的比值為1.73，說明提取的RNA質量較好。以此RNA為模板，反轉錄獲得cDNA第一鏈，最后利用特異性引物克隆獲得CT功能域的cDNA片段，長度約為1 600 bp，結果見圖3B。

2.4 粘紅酵母ACC CT功能域基因的原核表達

構建的重組表達載體pET-28a-CT通過測序分析證實重組表達載體中已經插入目的基因，序列正確，且讀碼框架未發生移碼突變。將構建成功的重組載體轉入表達菌株中25℃誘導表達，表達產物經過SDS-PAGE分析，與對照相比出現1條與預測蛋白62 ku大小相近的目的條帶，表明CT功能域基因成功表達，且表達量較高，見圖4A。大量誘導表達重組菌株，收集菌體后超聲波破碎，離心收集上清，進行Ni柱純化后，SDSPAGE電泳檢測結果見圖4B，純化后蛋白濃度達到1.8 mg/mL。

圖3 粘紅酵母總RNA的提取及CT功能域cDNA的擴增Fig.3 Total RNA of Rhodotorula glutinis and amplification of CT cDNA

圖4 CT功能域原核表達的SDS-PAGE結果Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expression of CT domain

3 討論

乙酰輔酶A在不同物種中的分類、定位及基因組織形式存在很大差異［5］，在酵母中ACC為同質型，由一條帶有BC、BCCP和CT 3個功能域的多肽鏈編碼，該酶的編碼基因在6.5～7 kb之間，且表達豐度不高，使用構建cDNA文庫的方法受到反轉錄酶合成性能的限制，難以合成其全長cDNA序列。本文采用簡并PCR和染色體步移法首次克隆獲得了粘紅酵母ACC基因的全長序列信息。其一，簡并PCR成功的關鍵在于簡并引物的設計［6］，應選擇保守性強簡并度低的氨基酸序列設計簡并引物，并且結合目標物種的密碼子偏愛性，進一步降低引物簡并度，提高簡并PCR的特異性。其二，基于PCR技術的染色體步移的方法雖然有很多，包括反向PCR、Tail-PCR、接頭PCR［10］、SON-PCR［11］、SEFA-PCR［12］等，但這些方法必須在特殊的PCR條件下進行，往往采用隨機引物和巢式PCR，擴增過程中的非特異性產物也沒有簡便的方法識別［10］。本研究利用Clonetech公司的GenomeWalker Universal kit將接頭PCR技術和抑制PCR技術結合起來，防止PCR的非特異性擴增，并且利用降落PCR程序進一步提高PCR擴增的特異性，最終成功獲得目的片段。

生物的油脂合成是一個復雜的代謝過程，而乙酰輔酶A羧化酶作為催化脂肪酸第一步反應的關鍵酶和限速酶，成為轉基因油料作物、生物柴油等基因工程研究的重要目標［13］。前人研究證明共表達異質型ACC的4個亞基(BC、BCCP、α-CT和β-CT)或過表達同質型ACC可以一定程度提高宿主的脂肪酸含量［3-4］。但在生物油脂合成這個復雜的代謝網絡中，油脂代謝是由多基因協同控制的，對單基因進行表達調控實現大幅度提高油脂含量難度較大，而且油脂合成還與其他代謝網絡密切相關，因此在整個過程中可能存在反饋抑制作用。例如，磷脂的合成和脂肪酸的合成就是共調節的，當磷脂合成速率低于脂肪酸合成的速率時，由此導致的酰基-酰基載體蛋白(acyl-ACPs)的累積會反饋抑制ACC［14］。上述因素都是后續工作中需要考慮的問題。

在植物中質體ACC控制著脂肪酸的合成。雙子葉植物質體ACC為異質型而禾本科植物質體ACC為同質型，針對這一點可以設計雜草敏感而對其他作物無影響的特異性除草劑［5］。Zhang等［15］通過對酵母CT晶體結構的研究闡明了除草劑是通過與CT功能域相互作用來抑制ACC的分子機制。隨著除草劑的廣泛使用，出現了很多抗性雜草，因此需要設計和篩選更多新型除草劑。本研究克隆和表達了粘紅酵母ACC的CT功能域基因，為設計新型除草劑及其機理研究提供了有價值的材料。

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