1株甲苯降解真菌的篩選鑒定及其降解甲苯的特性

段傳人，胡江，宋永安，朱成惠，唐菊，孫達

(1.重慶大學生物工藝實驗室，重慶400044;2.重慶有色金屬研究所有限公司，重慶400039)

苯系物是環境中分布較廣的一類有毒化合物，具有“三致效應”，被許多國家列入優先控制污染物［1-2］。甲苯是一種重要的溶劑和化工原料，甲苯使用量逐年增加，由此帶來的環境污染和對人體的健康危害也日益受到關注。人體吸入甲苯主要經呼吸道和皮膚吸收，短時間內吸入較高濃度甲苯可出現眼及上呼吸道明顯的刺激癥狀、眼結膜及咽部充血、頭暈、頭痛、惡心、嘔吐、胸悶、四肢無力、步態蹣跚、意識模糊。重癥者可有躁動、抽搐、昏迷。長期接觸可發生神經衰弱綜合征，肝腫大。因此尋找防治甲苯污染的對策刻不容緩，對人類的健康和環境保護具有重大意義。近年來，生物法處理苯系物污染以其簡單高效、能耗低、費用低、無二次污染等特點越來越受到重視［3］。與細菌為核心的生物工藝相比，絲狀真菌由于所產生的菌絲體易捕捉氣相中的疏水性污染物，同時又具備耐受低pH值和適應干燥環境等特性，而日益成為VOCs生物過濾技術中新的研究熱點［4］。國外分離降解苯、甲苯的真菌主要有宛氏擬青霉(Paecilomyces variotii)［5］、尖端賽多孢子菌(Scedosporium apiospermum)［6］、諾卡氏菌(Nocardia)［7］、孢瓶霉屬真菌(Cladophialophora)［8］、外甁霉(Exophiala oligosperma)［9］等，國內的研究較少，僅有侯晨濤［10］進行了相關研究，分離的真菌為霉菌(綠色木霉、宛氏擬青霉、文氏曲霉和頂孢頭孢霉)。白腐真菌是一類引起木質白色腐爛的絲狀真菌的總稱，白腐菌分泌多種生物酶參與芳香化合物的降解過程，并且可能按照不同的降解機制將芳香化合物降解，降解反應也不僅僅局限次生代謝階段和細胞外以及主要降解酶的非專一性，白腐菌對多環芳烴、烷基苯類、氯代芳香化合物及硝基苯類化合物等4大類芳香族化合物均有一定的降解能力［11］。多數研究者利用白腐真菌降解多環芳烴，而研究表明白腐菌也能降解揮發性有機物。Qi等［12］研究了5種白腐真菌以9種VOC(苯、甲苯、乙烯、苯乙烯等)的蒸汽作為碳源和能源，研究表明，黃孢原毛平革菌除了苯乙烯外的其他幾種VOC，這項工作為建立利用白腐菌對VOC污染進行治理的反應器模型(如生物濾池)提供了研究基礎。發現黃孢原毛平革菌能降解苯、甲苯、二甲苯、乙烯等揮發性有機化合物。黃孢原毛平革菌對揮發性有機物的降解發生在初級代謝。雖然白腐菌對非揮發性有機物化合物(包括PAH和其他難降解化合物)的降解能力的研究很多，但是白腐菌降解氣相VOC污染物的能力報道幾乎很少。近年來人們對白腐菌降解VOCs產生了濃厚的興趣，對其降解VOCs的機制進行了初步研究，對其在生物過濾法去除VOCs氣體污染的應用中進行了深入的實踐。白腐真菌主要通過細胞色素氧化酶(P450)和木質素降解酶系2種途徑來實現對污染物的降解。木質素降解酶系包括LiP、MnP、Lac 3種酶，這3種酶都是在白腐菌次生生長階段產生，利用這3種酶對底物進行降解時需要額外添加白腐菌生長所需要的營養物質。本文篩選到1株甲苯優勢降解菌H1，鑒定為毛栓菌(Trametes hirsuta)，該菌株是一種富產漆酶的白腐菌。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，對多種環境污染物具有降解能力。目前主要研究了真菌漆酶對多環芳烴類物質和氯酚類物質的降解規律［13］，毛栓菌及其漆酶對甲苯的降解的研究還很少。本實驗對毛栓菌生物學特性及甲苯降解特性進行了研究，為深入開發該菌用于含甲苯的污水和廢氣處理奠定了良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌種Phanerochaete chrysosporium

(編號5.776)購于中國科學院微生物研究所;Pleurotus ostreatus(編號1#)購于重慶市農科所;H1～H5采集于重慶縉云山，保存于本實驗室。

1.1.2 培養基(g/L)PDA培養基:土豆200，葡萄糖20，瓊脂18;土豆葡萄糖液體培養基:土豆200，葡萄糖20;限氮培養基:葡萄糖10，酒石酸銨0.2，苯甲醇0.54，KH2PO42.56，MgSO4·7H2O 0.71，維生素B10.001，微量元素液70 mL，10 mmol/L醋酸緩沖液調節pH至4.5;微量元素液:氨基乙酸0.6，MnSO4·H2O 0.5，NaCl 1，FeSO4·7H2O 0.1，CoCl2·H2O 0.19，CaCl2·2H2O 1.56，ZnSO4·7H2O 0.1，CuSO4·5H2O 0.1，KAl(SO4)2·12H2O 0.01，HBO30.01;無碳培養基:酒石酸銨2.0，Na2HPO40.47，KH2PO40.45，MgSO4·7H2O 0.5，無水CaCl20.01，MnSO4·H2O 0.001，FeSO40.001，ZnSO4·7H2O 0.001，CuSO4·5H2O 0.001。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選甲苯降解菌的篩選在含有50 mL基礎鹽培養基的250 mL磨口三角瓶中進行。將實驗室保藏的5株真菌(H1～H5)和購買的黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、糙皮側耳(Pleurotus ostreatus)接種到PDA平板置于30℃恒溫活化6 d，經過活化的菌種用10 mm的打孔器打孔，挑取2片菌片，置于50 mL甲苯濃度為200 mg/L的基礎鹽培養基中，用鋁箔將三角瓶的瓶口密封，以防止苯和甲苯的揮發，于30℃、150 r/min培養10 d。每天觀察記錄菌種的生長情況。氣相色譜法測定第10天7株菌株對甲苯的降解率。

1.2.2 菌株對甲苯降解率測定為了解菌株對甲苯的降解速率，將活化后的菌種分別接入50 mL的無機鹽培養基中，向培養基中投入433 mg/L的甲苯。甲苯濃度的測定采用氣相色譜法，氣相色譜儀為Agilent HP6890，檢測器為FID，柱子為Agilent DB-1，載氣為99.999%N2，流量為80 mL/min，檢測溫度240℃、柱相溫度80℃、汽化室溫度200℃。用微量注射器直接取三角瓶里的氣體，進樣量為100 μL。

1.2.3 優勢甲苯菌株的鑒定①菌株形態鑒定:菌種形態鑒定的方法和分類依據見參考文獻［10］;②菌種分子鑒定:提取H1基因組DNA作為模板，用真菌ITS的通用引物進行PCR擴增。上游引物ITS1(5'-TCCGATGGTGAACCTGCGG-3')，下游引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。擴增體系:模板(50 ng/μL)2 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)1 μL，引物(10 μmol/L)各1 μL，Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL，10×Taq緩沖液2.5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應條件:95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，循環30次，72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。回收PCR產物并與PUM-T質粒連接(反應體系為5 μL:PUM-T載體0.5 μL，PCR產物0.5 μL，連接緩沖液2.5 μL，T4連接酶0.5 μL，ddH2O 1 μL)，16℃連接過夜。轉化后挑陽性克隆提質粒，經酶切鑒定后測序(北京六合華大基因科技股份有限公司完成)，將測序序列與GenBank中的基因序列進行相似性比較。

1.2.4 優勢降解菌降解條件正交實驗設計本實驗采用的4因素為A培養溫度、B初始pH、C甲苯濃度、D吐溫添加量，采用4因素4水平正交實驗設計，見表1。用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L NaOH調節基礎培養基的pH值。

1.2.5 漆酶酶活測定［14］①酶液制備:對液體發酵的菌種，從第2天起每天定時取樣，具體步驟:在超凈工作臺中將培養了2 d的液體菌種10 mL倒入50 mL的離心管中，4 000 r/min離心15 min，取上清液作為待測樣品備用;②漆酶酶活測定:取待測酶液，對每種樣品進行3次平行實驗，實驗結果取平均值。漆酶(Lac)測定方法:取2 mL(濃度為50 mmol/L，pH值為4.5)乙酸-乙酸鈉緩沖液，加入1 mL粗酶液和1 mL(濃度為16 mmol/L)愈創木酚，組成4 mL的反應體系。在35℃時測定465 nm處光吸收值變化量。酶活單位的定義:1 min內吸光度增加0.01所需要的酶量為1 U。

表1 因素與水平的設置Table 1 Arrangement of factors and levels

2 結果與分析

2.1 甲苯優勢降解菌的篩選

圖17 株真菌對甲苯的降解能力比較Fig.1 Degradation ability comparison of seven toluene-degradlng bacteria

在甲苯作為唯一碳源的無機鹽培養基中，微生物菌體細胞只能通過對甲苯的降解，獲得生長所需的碳源。郭曉芬等［15］研究發現甲苯降解和菌體濃度變化具有一致性，利用菌體濃度變化是一種簡單、省時可行的評估方法。將7株真菌接種到甲苯初始濃度為200 mg/L的無機鹽培養基中培養10 d，每天記錄真菌的生長量(表2)，菌株H1菌體生長量顯著高于其余6株真菌菌體生長量。當培養第4天時，H1菌種開始生長，優先于黃孢原毛平革菌(第5天)和H5菌株(第5天)。采用氣相色譜法測定培養10 d后，7種真菌的培養基中剩余的甲苯濃度，由圖1可知，黃孢原毛平革菌、糙皮側耳、H1和H4菌株能夠降解甲苯，降解率分別為64.8%、50.2%、83.3%、62.9%。而菌株H2、H3、H4幾乎不能降解甲苯。綜上所述，選擇甲苯降解率最高的H1菌株作為降解甲苯的優勢菌株。

表2 7株真菌在甲苯作為唯一碳源的培養基中的菌絲量Table 2 Mycelium production by seven fungal strains growing on toluene as sole carbon

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態鑒定菌株在PDA培養基上生長情況:供試菌株在PDA培養基上接種2 d后便開始萌發。菌落呈白色，絨毛狀，菌絲致密，爬壁能力較強，菌落平展圓形(見圖2a)。菌絲電子顯微鏡觀察如圖2b所示:菌絲無色，長短、粗細不等，單個或數個相連，菌絲分枝、有鎖狀聯合。

圖2 菌株H1菌落形態和掃描電鏡照片Fig.2 Colonies morphology and scanning electron micrograph of strain H1

2.2.2 H1菌株的ITS序列測定及其系統發育樹的構建利用ITSrDNA通用引物對H1基因組DNA進行PCR擴增得到600 bp的目的DNA片段。同GenBank中的基因序列進行同源性對比。從結果中選取20株Trametes具有代表性的菌株，以ITS基因序列同源性為基礎，結果表明H1菌株的ITS序列與菌株Trametes hirsuta(EF546240.1)、Trametes hirsuta(FJ550367.1)ITS序列區具有100%的同源性。結合采用Clustal X2.0和MEGA 4.0(1 000次抽樣分析)軟件構建系統發育樹，如圖3所示。遺傳距離顯示菌株H1與Trametes hir-suta(EF546240.1)、Trametes hirsuta(FJ550367.1)的遺傳距離最近。根據形態特征和ITS序列分析結果，參見文獻［16］確定菌株H1為毛栓菌(Trametes hirsuta)。毛栓菌隸屬于擔子菌門非褶菌目多孔菌科栓菌屬，是重要的白腐真菌，栓孔菌多是重要的生物資源，在我國廣泛分布。查閱相關文獻，未發現該菌降解甲苯的報道。

圖3 H1菌株與Trametes sp.中典型菌株的系統發育樹圖Fig.3 Phylogenetic tree of the strain H1 with type strains of Trametes sp.

2.3 菌株H1對甲苯的降解曲線

菌株H1對甲苯的降解率隨時間變化如圖4所示，菌株H1在培養基體系中具有較長的適應期，在4 d即開始表現出一定的降解能力，降解率為10.4%，隨著培養時間的延長，降解效率逐漸增加，在最初的8 d里，甲苯的降解效率隨時間迅速升高，達到44.27%，但在隨后的幾天里降解效率趨緩。到12 d培養結束時達到最大降解率，最大降解率為57.17%。Demir G.［17］研究了雜色云芝(Trametes versicolor)在pH為5、溫度為28℃、轉速為150 r/min的條件下對4種不同濃度的苯、甲苯降解，該菌4 h內能將50 mg/L的苯甲苯完全降解，36 h能降解300 mg/L的甲苯，表明栓菌屬真菌能夠有效地降解甲苯。

圖4 H1對甲苯的降解率Fig.4 Toluene degradation rates of H1 strain

2.4 正交實驗結果與分析

微生物生長以及對甲苯的利用受到培養基組成、溫度、pH、甲苯濃度等許多因素的影響，提供最適條件可加速甲苯的降解，反之則會降低微生物降解甲苯速率。目前報道的菌種最適降解條件不能間接或直接來自其他菌株培養所用，因此通過優化降解條件，甲苯降解速率可能會得到進一步提升。本實驗對4個因素(溫度、pH、初始甲苯濃度、吐溫添加量)進行了正交實驗。表4的分析結果方差結果表明，甲苯濃度、溫度、pH對降解率的差異極顯著，吐溫添加量對降解率的影響不顯著，4因素的主次順序為甲苯濃度＞pH＞溫度＞吐溫添加量。吐溫添加量在0～1 mL/L之間對甲苯的降解率影響不大，溫度在20～35℃、pH在5～8、初始甲苯濃度在50～500 mg/L之間變化都對甲苯的降解率有不同程度的影響。由表3可以看出，菌株H1降解甲苯的最佳條件為A3B3C1D2，即當甲苯初始濃度為300 mg/L，溫度為30℃，pH為5.0，吐溫添加量為0.05%時，培養10 d，H1菌株對甲苯的降解效果最好，降解率為85.3%。一定濃度的吐溫80可以顯著提高水相中苯系物的溶解度，增大微生物與底物的接觸幾率，增加生物可利用率，提高酶促反應;吐溫濃度過高則會抑制微生物對底物的降解，吐溫80與底物成競爭關系。由于本實驗選取的吐溫80濃度較低，所以對甲苯的降解率的影響不顯著。

表3 L16(44)正交實驗結果Table 3 Results of L16(44)orthogonal experiment

表4 正交實驗結果方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal test

2.5 H1菌株在3種培養基中的產漆酶能力比較

圖5 H1菌株在3種培養基中的漆酶活性Fig.5 The laccase activity produced by H1 in three kinds of medium

漆酶(Laccase)是一種含銅的多酚氧化酶，漆酶在生物制漿、生物漂白、脫色以及有毒化合物的降解等方面具有廣泛的應用前景。H1菌株所屬的栓菌屬是真菌漆酶的研究熱點。本實驗選擇了限氮培養基、土豆葡萄糖液體培養基、無機鹽培養基作為供試培養基，測定H1菌株在3種培養基中的產酶情況，由圖5可知，第7天時H1在3種培養基培養出現產酶高峰期，H1在限氮培養基、土豆葡萄糖液體培養基、無機鹽培養基的酶活分別為5 540、16 500、589 U/L。在甲苯為唯一碳源的無機鹽培養基中，漆酶酶活小于H1菌株在土豆培養基和限氮培養基中漆酶的酶活，可能是由于甲苯作為碳源時限制了漆酶的分泌。司靜等［18］通過正交實驗方法對篩選到的漆酶高產菌株東方栓孔菌(Trametes orientalis Cui 6300)的漆酶產酶條件進行優化，優化后漆酶酶活最高可達19 923 U/L。本實驗H1菌種在未優化的條件下漆酶酶活最高可達16 500 U/L，由此表明H1菌株是1株漆酶高產菌株。

3 討論

甲苯的使用越來越廣泛，其危害給人類健康帶來了巨大的威脅。自然界的某些微生物能夠通過體內的降解酶將甲苯降解為水和CO2。在目前已報道的苯系物降解微生物中，主要分布在細菌中的假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)［19］、不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)［20］、芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)［21］和紅球菌屬(Rhodococcus sp.)［21］，但對真菌降解苯系物的報道還比較少。在已分離到的菌種中銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)［22］在28℃、pH 7.0、初始甲苯濃度為500 mg/L條件下，該菌48 h降解率達到99.2%。嗜吡啶紅球菌［23］PYJ-1(Rhodococcus pyridinovorans)在pH 7.0，溫度為32℃時能降解50 mg/L的甲苯。本實驗從實驗室保存的7株真菌中篩選到1株甲苯高效降解菌毛栓菌(Trametes hirsuta)H1，該菌甲苯在初始濃度為300 mg/L，溫度為30℃，pH為5.0，吐溫添加量為0.05%時，培養10 d，H1菌株對甲苯的降解效果最好，降解率為85.3%，菌株優化后的甲苯降解率比優化前提高了28.13%。本實驗還表明毛栓菌H1菌株在甲苯的底物濃度在50～500 mg/L、溫度在20～35℃、pH在5～8的范圍內對甲苯均有一定的降解效果，說明該菌對溫度、甲苯濃度和pH都有較好的適應性，這有助于該菌在生物過濾塔處理甲苯廢氣中的應用。章劍麗等［22］研究了吐溫80的添加量對混合細菌降解苯系物的影響，發現吐溫80的添加量能對苯系物的降解率產生明顯影響。一定濃度的吐溫80可以顯著提高水相中苯系物的溶解度，增大微生物與底物的接觸幾率，增加生物可利用率，提高酶促反應。由于本實驗選取的吐溫80濃度的范圍較窄，所以對甲苯的降解率沒有極顯著影響。

甲苯在微生物中的降解途徑有多種，單加氧酶和雙加氧酶是細菌降解甲苯的關鍵酶。在白腐真菌中，木質素酶系在白腐菌對污染物的降解中有非常重要的作用。然而，木質素酶系參與BTEX(苯系物)降解中的研究還非常少。Yadav等［24］發現P.chrysosporium在不產生木質素酶的條件下降解BTEX，而通過2，3-苯雙加氧酶使單環芳烴開環。Elisabet Aranda等［25］首次發現T.versicolor中的漆酶等木質素酶通過產生·OH參與了BTEX的降解，木質素降解酶系和·OH在BTEX降解中的具體作用還有待進一步研究。本研究H1菌株以甲苯為唯一碳源降解甲苯時，漆酶的酶活為589 U/L，遠遠小于葡萄糖作為碳源時H1菌株的漆酶酶活。H1菌株的漆酶等木質素酶是否參與了甲苯的降解以及H1菌株降解甲苯途徑的機制有待進一步研究。

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