β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆與序列分析

孫軍濤, 王洪新, 呂文平＊, 馬朝陽, 戴易興, 姚紅

(1.食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,江蘇無錫 214122;2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆與序列分析

孫軍濤1,2, 王洪新1,2, 呂文平＊1,2, 馬朝陽1,2, 戴易興1,2, 姚紅1,2

(1.食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,江蘇無錫 214122;2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

依據GenBank中收錄的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquef aciens)β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,設計特異性引物,以提取的解淀粉芽孢桿菌基因組DNA為模板,利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增獲得758 bp的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl),將此目的基因克隆至p TG19-T Easy載體中,經PCR、限制性內切酶鑒定和克隆片段的序列測定、比較,結果表明該克隆片段擴增準確、可靠。序列比較發現,此片段與解淀粉芽孢桿菌(B.am y loliquefacines,M 15674)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis,D00518)和地衣芽孢桿菌(B.licheniform is,A Y365256)分別有99%、95%和94%的同源性。

解淀粉芽孢桿菌;β-1,3-1,4-葡聚糖酶;克隆;序列分析

β-1,3-1,4-葡聚糖是禾本科高等植物(谷物類)細胞壁的多糖組分,是由1 200個以上的β-D-葡萄糖殘基通過β-1,3和β-1,4糖苷鍵連接而成的線性分子,在大麥、燕麥、高粱、大米和小麥等谷物胚乳細胞壁中的含量尤為豐富,不同谷物β-葡聚糖中兩種糖苷鍵鍵型的比例和寡糖單元的長度有所不同,如大麥,90%以上的水溶性β-葡聚糖是由單一的β-1,3糖苷鍵連接纖維三糖和纖維四糖所組成[1]。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶 (1,3-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase, 1, 3-1, 4-glucanase,E.C.3.2.1.73,簡稱β-葡聚糖酶或地衣多糖酶),它是只降解β-葡聚糖中與β-1,3糖苷鍵相鄰的β-1,4糖苷鍵的酶,其降解產物主要是纖維三糖和纖維四糖[2]。它是一種有經濟價值的工業用酶,在啤酒釀造中常用于糖化或發酵以提高啤酒質量和穩定性[3],并且作為飼料添加劑也能夠有效的提高飼料轉化率[4-5]。但是現有的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的耐熱性較差、酸性條件下活性較低,在工業應用中,較高的加工溫度或酸性環境,就會使β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性降低甚至失活,限制了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的應用范圍,增加生產成本。因此,開發出在高溫、強酸條件下具有高活性的β-1,3-1,4-葡聚糖酶將具有很好的社會經濟價值。

許多不同來源的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因已經克隆得到,如芽孢桿菌屬[6-10]、球菌[11]和真菌[12]等,并在大腸桿菌(Escherichia coli)、芽孢桿菌(Bacillus strains)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及其他轉基因植物大麥和煙草等不同宿主菌中進行了表達。通過單一菌株的基因的克隆表達、定點誘變以及基因缺失等手段得到的β-1,3-1,4-葡聚糖酶在耐熱、耐酸和活性方面不夠理想。隨著分子生物學技術的發展,基因重疊延伸PCR技術在基因工程中有很好的應用,通過此技術采用具有互補末端的引物,使PCR產物形成重疊鏈,從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸,將不同來源的擴增片段重疊拼接起來[13]。為了獲得工業生產條件下具有較高熱穩定性的酶,將不同來源的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因通過基因重疊延伸PCR技術進行雜合,構建雜合基因工程菌,表達出適合工業生產需要的雜合酶將是一種較好的手段。

作者以解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)為研究對象,克隆了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因,并對基因序列進行了分析,為進一步構建耐熱、耐酸高活性的β-1,3-1,4-葡聚糖酶奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質粒 解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquef aciens)、DH5a由作者所在實驗室保存。

1.1.2 培養基與試劑 LB培養基(g/L):蛋白胨10,酵母膏5,氯化鈉10。氨芐青霉素的使用濃度為100μg/m L,固體培養基按2%的量加入瓊脂。

限制性內切酶BamH I、XhoI、T4 DNA 連接酶、TaqDNA 聚合酶、p TG19-T Easy Vector、DL 2000 M arker、小量質粒快速提取試劑盒均購于上海捷瑞生物工程公司;X-gal和IPTG購于Sigma公司;其他主要試劑均為國產AR級產品。

1.2 儀器與設備

PCR儀 PTC-2000:美國MJ公司產品;凝膠成像透射儀chemi system:美國UVP公司產品;One Drop Spectrophotometer OD-1000:上海采邑生物科技有限公司產品;冷凍氣浴恒溫振蕩器BS-1E:金壇市瑞華儀器有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 解淀粉芽孢桿菌基因組DNA提取 活化的解淀粉芽孢桿菌接種到LB培養基中,37℃下200 r/mim振蕩培養過夜,收集菌液按照小量質粒快速提取試劑盒提供的方法提取解淀粉芽孢桿菌基因組DNA,用1.5 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進行檢測。同時用OD-1000紫外、可見光分光光度計檢測DNA濃度和純度。

1.3.3 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因的PCR擴增以提取的解淀粉芽孢桿菌基因組DNA為模板,利用PCR擴增β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因,反應體系(50μL):10 ×PCR buffer 5μL,M gCl2(25 mmol/L)2.5μL,dN TP(10 mmol/L)1μL,引物各2μL,模板3μL,Taq酶(5 U/μL)0.5μL,重蒸水 34μL。PCR反應條件:94℃2 min;94℃1 min;42℃1 min,每循環增加0.1℃,72℃1 min,重復30次;72℃10 min;4℃保存。

1.3.4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆 PCR產物經1.5 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳,割膠回收試劑盒回收目的基因片段,回收產物與p TG19-T vector 4℃連接過夜,連接產物加入感受態DH5a中,冰浴30 min,42℃下熱激45 S,立即放入冰浴中5 min,加入800μL的LB培養基,37℃下200 r/mim振蕩培養1 h。將轉化好的菌液接種在含有氨芐青霉素的LB平板上(已經涂過X-gal和IPTG)37℃過夜培養,挑取白色菌落,接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養基中,37℃過夜培養。提取質粒備用。

1.3.5 陽性克隆的鑒定

1)PCR鑒定 以提取的重組克隆質粒進行PCR擴增,反應體系和條件同基因擴增,擴增產物用1.5 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2)BamH I和XhoI雙酶切鑒定 酶切反應體系為:buffer 2μL,BamH I 1μL,Xho I1μL,克隆質粒8μL,無菌水8μL;混勻,37 ℃酶切4 h后,65℃滅活15 min,酶切產物經1.5 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.6 測序及序列分析 經PCR和酶切鑒定為陽性的克隆質粒送上海生物工程公司進行測序。應用DNA Tools軟件對β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的核苷酸序列進行分析,將推導的氨基酸序列與 Gen-Bank上發表的已知序列做同源性比較與分析。

2 結果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌基因的提取

通過瓊脂糖凝膠電泳對所提取的DNA進行檢查可以清晰地看到特征性條帶,證明得到了解淀粉芽孢桿菌的基因。用OD-1000紫外、可見光分光光度計檢測DNA的質量濃度為215.33 ng/μL,A260和A280之比為1.954,符合1.8～2.0的要求,說明DNA的純度較高,可用于PCR的擴增。

2.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因的 PCR擴增

以解淀粉芽孢桿菌基因組DNA為模板,進行PCR擴增出的目的片段在750 bp左右,其條帶單一,特異性強,表現與目的基因預期大小一致的條帶,瓊脂糖電泳圖如圖1。

2.3 陽性克隆的鑒定

2.3.1 PCR鑒定 在LB平板上篩選白斑,得到一些陽性克隆子。挑取得到的白斑于LB液體培養基中培養,提取質粒,經PCR擴增后,瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2,克隆得到的基因片段與目的基因片段大小一致,說明目的基因片段 bgl已經插入到p TG19-T vector中。

圖1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因的 PCR擴增Fig.1 Gel electrophoresis analysis of PCR amplification product ofβ-1,3-1,4-glucanase gene

圖2 陽性克隆子PCR鑒定電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis analysis of PCR amplification product of positive cloning plasm id

2.3.2BamH I和XhoI雙酶切鑒定 克隆載體經BamH I和XhoI雙酶切后,瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3,與未經酶切的克隆質粒對比發現,在750 bp左右出現明顯的條帶,進一步證實β-1,3-1,4-葡聚糖酶目的基因已經插入到p TG19-T vector中,成功獲得陽性克隆子p TG19-T-bgl。

圖3 陽性克隆子雙酶切電泳圖Fig.3 Restriction enzyme cutting of positive clon ing plasm id

2.4 測序結果及序列分析

序列測定結果表明,克隆得到的β-1,3-1,4-葡聚糖酶擴增片段全長為758 bp,已被 GenBank收錄(Accession A Y205562)。如圖4,與預期長度相同。經Blast同源性分析結果表明,克隆得到的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因與 GenBank登錄的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquef acines,M 15674)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis,D00518)和地衣芽孢桿菌(B.licheniform is,A Y365256)分別有 99%、95%和94%的同源性。用DNA Tools分析表明,該基因ORF為717 bp,編碼239個氨基酸,計算相對分子質量為26 807,等電點為6.51,其中疏水性氨基酸占36.8%,親水性氨基酸占44.8%,酸性氨基酸占8.8%,堿性氨基酸占9.6%。

圖4 解淀粉芽孢桿菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶核苷酸序列及其推譯的氨基酸序列Fig.4 The nucleotides sequence and its deduced amino acid sequence ofβ-1,3-1,4-glucanade from Bacillusamyloliquefaciens

3 結 語

β-1,3-1,4-葡聚糖酶是一種重要的工業用酶,廣泛應用于釀酒和飼料工業。β-葡聚糖在啤酒生產和飼料加工過程中會產生一些問題,如降低麥芽汁和啤酒過濾速度、影響啤酒風味、在啤酒儲存過程中易引起沉淀;過多的β-葡聚糖增加飼料的粘性和不可消化性,降低飼料的營養價值。在啤酒生產和飼料加工過程中,由于高溫、低p H的條件,往往使谷物內源性β-1,3-1,4-葡聚糖酶失活,因此添加適量的耐熱、耐酸、活性高的β-1,3-1,4-葡聚糖酶能夠解決工業生產中β-葡聚糖引起的負面影響。但現有的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的熱穩定性、耐酸性較差,在釀酒和飼料工業應用時增加了生產成本。通過分子生物學技術構建適應工業需要的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,降低其在釀酒和飼料工業應用時的生產成本,已經成為近年來的熱點。

作者根據 GenBank提供的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因已知序列,應用Primer5軟件設計特異性引物,運用PCR及T-A克隆技術成功獲得了包含758 bp的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因片段,并與p TG19-T Easy Vector載體連接,經 PCR、酶切和測序鑒定,結果與 GenBank報告的序列完全一致,成功構建出p TG19-T-bgl真核表達載體,為下一步構建耐熱、耐酸、活性高的雜合β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因奠定基礎。

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Cloning and Sequence Analysis ofβ-1,3-1,4-Glucanase Gene

SUN Jun-tao1,2, WANG Hong-xin1,2, LV Wen-ping＊1,2,M A Chao-yang1,2, DA I Yi-xing1,2, YAO Hong1,2

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Based on the sequence alignment ofBacillus amyloliquef aciens,two pairs of primers were designed and synthesized in this study.Using the total DNA ofBacillus amyloliquef aciensas temp late,the gene ofβ-1,3-1,4-glucanase(bgl)was amplified by PCR,which has about 750 bp in length.The gene was cloned into pTG19-T Easy vector,and the recombinant plasm id was identified by PCR,restriction enzyme analysis and sequencing.The homology analysis revealed that the nucleotide sequences of the clonedβ-1,3-1,4-glucanase gene sim ilar to the B.amyloliquef acines(M 15674),B.subtilis(D00518)andB.licheniform is(A Y365256)were 99%,95%and 94%,respectively.

Bacillus amyloliquef aciens,β-1,3-1,4-glucanase,cloning,sequence analysis

＊通信作者：呂文平(1968-),男,山西壽陽人,工學博士,副教授,主要從事生物技術研究。Email:lwpkxy@163.com

Q 556.2

A

1673-1689(2011)04-0618-05

book=622,ebook=312

2010-08-11

國家自然科學基金項目(20090964);無錫市科技創業計劃(CIE00920)。

孫軍濤(1982-),男,河南漯河人,食品科學與工程博士研究生,主要從事食品營養與安全研究。Email:jtsfly@163.com