白蟻共生放線菌的抗菌活性篩選及菌株BY02的初步鑒定

胡松英，張應烙，2*，黃娟翠，方鄭，黃如柏，向婷婷

(1.浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華321004;2.南京大學醫藥生物技術國家重點實驗室，江蘇南京210093)

放線菌是產生抗生素最多的一類微生物，目前世界上已經發現的抗生素80%是由放線菌產生的，但研究放線菌的對象長期集中在來自土壤、水體等環境微生物，從中分離得到的化合物往往是已知化合物，出現全新骨架活性化合物的幾率已經很低，趨同的環境和重復的研究使得新天然藥物的發現率從上世紀80年代開始逐年下降。但與此同時，近年來在制藥領域的進步也使得人們對藥用活性物質的來源與特性有了更高的要求，已有結構特征的化合物不能適應病原的快速變化，而傳統來源的天然產物發現的途徑也難以滿足具有新結構特征或新作用特點化合物發現的需要。因此，為了發現新型天然藥源分子，尋找新的特境微生物資源顯得尤為必要。昆蟲共生菌是一類研究較少的特境微生物，是新穎天然產物的廣泛來源［1］。在較系統研究大刀螳螂、棉蝗和負蝗共生菌活性代謝產物的基礎上［2-4］，活性篩選表明1株黑翅土白蟻共生放線菌具有較好的抗菌活性，本文報道該活性菌株并初步確定其分類地位，旨在為開發新型微生物源殺菌劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集供試黑翅土白蟻采自浙江師范大學校園內。

1.1.2 供試植物致病菌供試植物致病菌為:蘋果腐爛病菌(Valsa mali)、楊樹潰瘍病菌(Dothiorella gregaria)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)，均由西北農林科技大學植物病理研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 共生放線菌的分離及其發酵產物的提取

利用平板分離法從黑翅土白蟻中分離到10株共生放線菌［4］，將分離到的10株菌株分別接種于

裝有50 mL高氏一號培養液的250 mL的三角瓶中，30℃、150 r/min條件下，搖床培養7 d。所得發酵液經6～8層紗布過濾，濾液分別用乙酸乙酯萃取3次，萃取液經減壓濃縮得粗浸膏。用丙酮定容，使粗浸膏最終質量濃度為1.0 mg/mL。

1.2.2 BY02發酵產物不同極性物質的提取參照1.2.1，對BY02進行液體發酵并得到發酵濾液，濾液依次用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液經減壓濃縮得二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物。用丙酮定容，使各提取物最終質量濃度均為1.0 mg/mL。

1.2.3 共生放線菌提取物抑菌活性測定采用生長速率法測定發酵提取物對植物病原菌的抑制活性［2］，具體操作過程參照馮俊濤等［5］方法。帶毒培養基的制備:取所制備的白蟻共生放線菌提取物1 mL于滅菌的10 mL試管中，加入9 mL 50℃左右PDA培養基，搖勻，倒入滅菌培養皿中即成，使帶毒培養基中提取物的最終質量濃度為0.1 mg/mL，以等量丙酮作為陰性對照。將活化的植物病原菌用無菌平板打孔器打成直徑5 mm的菌塊，置于培養基上，每處理3次重復，培養7 d后，采用十字交叉法測量供試菌菌落直徑。按如下公式計算抑制率:抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-5 mm)×100%。

1.2.4 BY02菌株鑒定①BY02形態特征觀察:采用插片法，將菌種接種于高氏合成一號培養基上，30℃插片培養6～15 d后，取插片在高倍鏡下觀察菌絲及孢子絲的形態特征，按照《鏈霉菌鑒定手冊》對菌株進行初步鑒定［6-7］;②16S rRNA基因序列分析:用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取樣品的基因組DNA，采用通用引物7f(5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')和1 540r(5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')按照常規方法進行PCR擴增。PCR擴增程序為:98℃5 min，95℃35 s，55℃35 s，72℃1 min，35個循環，延伸8 min。PCR產物經純化后由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。獲得的16S rRNA序列提交GenBank并獲取登錄號。對菌株的16S rRNA序列進行BLAST比對，選取相似序列，利用MEGA 4.0軟件構建系統進化樹，根據菌株的形態和16S rRNA序列分析結果初步確定菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 10株共生放線菌提取物對3種植物病原菌菌絲生長的抑制作用

10株共生放線菌提取物對3種病原真菌菌絲生長抑制作用結果見表1。在供試質量濃度為0.1 mg/mL時，10株共生放線菌提取物對所有3種供試植物病原真菌菌絲生長均有一定的抑制作用;BY02提取物的抑菌活性最好，對所有供試菌抑制率均在80%以上，其中對蘋果腐爛病菌表現強烈抑制作用，抑制率為100%;BY01和BY06抑菌活性次之，對所有供試菌抑制率均在40%以上，其中對蘋果腐爛病菌也表現強烈抑制作用，抑制率為100%。

表1 10株共生放線菌提取物對植物病原菌菌絲生長的抑制作用Table 1 Inhibiting effect of extracts from ten actinomycete strains on hypha of plant pathogens

2.2 BY02發酵產物不同極性物質對3種植物病原菌菌絲的生長抑制作用

BY02發酵產物不同極性物質對3種病原菌菌絲的生長抑制作用結果見表2。從表中數據可看出，BY02發酵產物的乙酸乙酯提取物活性最好，對所有3種供試菌的抑制率均大于80%;BY02發酵產物的二氯甲烷提取物抑菌活性次之，對2種供試菌的抑制率均大于70%，BY02發酵產物的正丁醇提取物抑菌活性最差，僅對1種供試菌的抑制率大于70%。上述結果表明BY02發酵產物抗菌活性物質主要集中在中等極性部分。

表2 BY02發酵產物不同極性物質對植物病原菌菌絲的生長抑制作用Table 2 Inhibiting effect of different polar fractions from the strain BY02 on hypha of plant pathogens

2.3 BY02菌種鑒定

2.3.1 形態特征觀察在高氏1號固體培養基上，BY02的菌落干燥，質地致密，與培養基結合緊，呈顆粒狀。采用插片法培養，鏡檢發現該菌株的基內菌絲和氣生菌絲都發育良好，基內菌絲無橫隔，不斷裂，顏色為黃褐色，不產生孢子，產生黃色的可溶性色素;氣生菌絲彎曲、白色，氣生菌絲上產生螺旋狀孢子絲，孢子圓形。這些特點都與鏈霉菌的特征相符，初步鑒定該菌株為鏈霉菌屬(Streptomyces)放線菌。

2.3.2 16 S rRNA序列分析BY02的基因組DNA電泳圖譜及16S rRNA擴增產物電泳圖譜見圖1和2，BY02的基因組DNA片段在10 000 bp左右，其16S rRNA擴增產物為1 418 bp，該菌的16S rRNA基因序列已登錄于GenBank，獲取的登錄號為JF412027。菌株BY02與Streptomyces parvulus(AB184326)的同源性達99.5%，親緣關系最近，在系統發育樹上處于同一分支(圖3)。故將BY02菌株初步鑒定為Streptomyces parvulus。

圖1 菌株BY02的基因組DNA電泳圖Fig.1 Electeophoresis of BY02 genome

圖2 菌株BY02 PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electeophoresis of result by PCR of BY02

圖3 基于16S rRNA基因序列構建的菌株BY02與鏈霉菌屬相關菌株之間的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of BY02 and representatives

3 小結與討論

本研究從黑翅土白蟻共生放線菌中篩選分離得到1株具有較好抗菌活性的菌株BY02，其抗菌活性物質主要集中在中等極性部分，經形態學觀察和16S rRNA序列分析初步確定該菌株為Streptomyces parvulus。如前言部分所述，昆蟲共生菌是新穎天然產物的廣泛來源［1］，進一步對菌株BY02的次生代謝產物研究，將有希望從中發現結構新穎的抗菌先導化合物，BY02作為微生物源殺菌劑值得進一步研究。

［1］ 張應烙.昆蟲腸道真菌的新活性物質研究［D］.南京大學博士學位論文，2008.

［2］ Zhang Y L，Kong L C，Jiang D H，et al.Phytotoxic and antifungal metabolites from Curvularia sp.FH01 isolated from the gut of Atractomorpha sinens［J］.Bioresource Technology，2011，102(3):3575-3577.

［3］ Zhang Y L，Ge H M，Li F，et al.New phytotoxic metabolites from Pestalotiopsis sp.HC02，a fungus residing in Chondracris rosee gut［J］.Chemistry and Biodiversity，2008，5(11):2402-2407.

［4］ Zhang Y L，Ge H M，Zhao W，et al.Unprecedented immunosuppressive polyketides from Daldinia eschscholzii，a mantis-associated fungus［J］.Angewandte Chemie International Edition，2008，47(31):5823-5826.

［5］ 馮俊濤，石勇強，張興.56種植物抑菌活性篩選試驗［J］.西北農林科技大學學報，2001，29(2):65-68.

［6］ 中國科學院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊［M］.北京:科學出版社，1975.

［7］ 閻遜初.放線菌的分類和鑒定［M］.北京:科學出版社，1992.