M-26堿性木聚糖酶的分離純化及酶學性質研究

慕娟，問清江，李葉昕，黨永

(陜西省微生物研究所，陜西西安710043)

木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶，其中包括內切β-木聚糖酶和外切β-木聚糖酶，可以切割主鏈內部的糖苷鍵或從非還原端逐一切割單糖而將木聚糖水解，降解產物分別為低聚木糖或木糖［1］。關于木聚糖酶的研究起始于20世紀60年代，現在已知能夠產生木聚糖酶的菌種包括細菌、真菌、霉菌等，不同來源的木聚糖酶的催化特性是有差異的［2］，有不同的最適pH和最適作用溫度，可以應用于造紙工業、食品工業、飼料工業、制藥工業等眾多領域［3-6］。堿性木聚糖酶可以作為生物漂白劑應用于造紙工業，減少傳統漂白工藝中氯用量，降低排污負荷，有利于環境保護，同時還可以改善紙張品質。已選育出的產堿性木聚糖酶的短小芽胞桿菌M-26，最高產酶活力可達625 IU/mL，具有良好的開發價值。為了更好地開發堿性木聚糖酶產品，從M-26發酵液分離純化堿性木聚糖酶，并對其酶學性質進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種短小芽胞桿菌M-26。

1.1.2 試劑樺木木聚糖(brich wood xylan)，Sigma公司產品;3，5-二硝基水楊酸(DNS)，化學純;sephadexG-25(國產);cellulose DE-52(Sigma公司);其他試劑為市售分析純。

1.1.3 儀器層析柱:1.5 cm×10 cm，1.5 cm×30 cm;GL-20M冷凍離心機(上海);BYY-10C電泳儀(北京);752紫外分光光度儀(上海);722分光光度儀(上海);LGJ-冷凍干燥機(河南)。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備M-26發酵液4 000 r/min低溫離心15 min，收集上清液為粗酶液。

1.2.2 (NH4)2SO4鹽析用量的確定分別取10 mL上清液，加入(NH4)2SO4至飽和度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%，充分混合均勻;4℃，放置過夜;4℃，4 000 r/min離心15 min，收集沉淀，測定沉淀的酶活和蛋白含量。計算木聚糖酶的收率和比活，并由此來確定最適鹽析(NH4)2SO4的用量。

1.2.3 sephadexG-25脫鹽取固體酶制劑0.1 g溶于2 mL無離子水中，4 000 r/min離心5 min，取上清液作為上柱樣品，上樣到sephadexG-25柱(1.5 cm×30 cm)中。用無離子水洗脫，流速為1 mL/min，每管收集5 mL。對各收集管測定木聚糖酶酶活和蛋白含量，根據酶活高低及比活收集并濃縮。

1.2.4 cellulose DE-52離子交換層析將sephadexG-25脫鹽得到的酶樣品加樣到cellulose DE-52(1.5 cm×10 cm)柱中。以含有不同濃度(0.2～1.0 mol/L)NaCl的pH 7.6的Tris-HCl溶液進行梯度洗脫，流速為1 mL/min，每管收集5 mL。對各收集管測定木聚糖酶酶活和蛋白含量，根據酶活高低及比活收集并濃縮。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量配制15%的分離膠，6%的濃縮膠，用制膠槽制膠。將蛋白質樣品與2×電泳緩沖液以1∶1混勻，沸水浴5 min，冷卻，上樣，上樣量為7 μL，電泳160 V，1 h。

1.2.6 酶學性質分析①木聚糖酶反應的最適pH:用不同pH值的緩沖液適當稀釋酶液，使酶反應在不同pH值條件下進行，測定酶活力;②木聚糖酶反應的最適溫度:適當稀釋酶液，分別在45、50、55、60、65℃溫度條件下進行，測定酶活力;③pH對木聚糖酶穩定性的影響:分別用pH 7.6、8.0、8.6、9.0、9.6的緩沖液適當稀釋酶液，4℃，放置24 h，測定其殘余酶活力;④溫度對木聚糖酶穩定性的影響:酶液分別在50、55、60、65、70℃下放置1 h，并每隔10 min取樣，測定其殘余酶活力。

1.2.7 金屬離子對M-26堿性木聚糖酶活力的影響在適當稀釋的酶液中加入濃度分別為5 mmol/L的Fe2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Al3+、Mn2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+，測定其酶活。

1.2.8 木聚糖酶活力測定采用DNS法測定木聚糖酶活力。配制1 mg/mL木糖標準溶液，分別量取0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 mL木糖標準溶液，用蒸餾水補齊1 mL，再加入2 mL DNS，沸水浴2 min，流水冷卻后加蒸餾水至10 mL，在540 nm進行光吸收測定，繪制木糖標準曲線，得出回歸方程用于酶活測定。發酵液經4 000 r/min離心15 min后取上清液，即為粗酶液。將粗酶液經適當稀釋后，取0.5 mL酶液加入0.5 mL 1%的木聚糖溶液，50℃準確反應10 min，加入2 mL DNS終止反應，煮沸2 min顯色，然后流水冷卻至室溫，定容至10 mL，以蒸餾水為對照，540 nm測定吸光值，根據回歸方程得出水解液中木糖含量，從而確定酶活。酶活單位定義:上述條件下，每分鐘釋放1 μmol還原糖(以木糖計)所需要的酶量定義為1個酶活力單位(IU)。

2 結果與分析

2.1 (NH4)2SO4鹽析用量的確定及M-26堿性木聚糖酶制劑的制備

如圖1所示，當(NH4)2SO4的飽和度為50%時，酶的蛋白含量和酶活均較高，所以取此飽和度為最適酶蛋白鹽析的硫酸銨溶液飽和度。用硫酸銨鹽析制備堿性木聚糖酶，硫酸銨溶液的最適飽和度為50%;采用冷凍干燥法進行酶的干燥，酶的回收率為85%以上;由表1、表2可知，基礎產酶條件下，酶制劑中活力為7 000 IU/g，經過碳源、氮源、金屬離子等產酶培養基研究，生長曲線、接種齡、發酵時間等發酵條件研究后，酶制劑中活力提高為9 500 IU/g。

圖1 M-26木聚糖酶鹽析曲線Fig.1 The curve of M-26 xylanase salting out

表1 基礎產酶條件制備酶制劑結果Table 1 The result of M-26 xylanase producing in basal medium

表2 優化產酶條件制備酶制劑結果Table 2 The result of M-26 xylanase producing in fermentation condition

2.2 sephadexG-25層析

將粗品酶液經sephadexG-25柱層析(見圖2)，有一個主峰，此峰下的木聚糖酶活性高，將其收集合并凍干后用于下一步分離純化用。

圖2 M-26木聚糖酶sephadexG-25層析Fig.2 Chromatography of M-26 xylanase on SephadexG-25

2.3 cellulose DE-52離子交換層析

由圖3可見，經cellulose DE-52離子交換層析后，有一個酶峰，將酶峰收集合并凍干。經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量。木聚糖酶脫鹽樣品流經該柱，酶蛋白與cellulose DE-52的親和力小于雜蛋白，首先被洗脫出來，如圖3所示，第1個洗脫峰酶活力最高，因此該峰為堿性木聚糖酶蛋白峰，而雜蛋白的親和力比堿性木聚糖酶蛋白強而被緊密吸附，從而分離出木聚糖酶，達到純化目的。

圖3 M-26木聚糖酶cellulose DE-52層析Fig.3 Chromatography of M-26 xylanase on cellulose DE-52

2.4 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量和蛋白純度

用SDS-PAGE檢測純化過程中蛋白質的變化情況及純度。如圖4，隨著純化的進行，酶樣品中雜蛋白逐步被去除，經過cellulose DE-52，蛋白質基本達到電泳純。分子量范圍在21.0～20.9 ku之間。存在2條蛋白帶，主帶接近20.1 ku，次帶接近29.0 ku。2個蛋白條帶，次帶是否為主帶蛋白的亞基，還有待進一步研究。

圖4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.4 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis

2.5 M-26堿性木聚糖酶的分離純化結果

木聚糖酶的分離純化如表3所示，sephadexG-25脫鹽后，酶的比活為75.77 IU/mg蛋白，純化倍數為11.93，酶的回收率36.33%;再經cellulose DE-52離子交換層析后，酶的比活為126.32 IU/mg蛋白，純化倍數為19.89，酶的回收率12.83%;SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量，分子量約為20 000多。

表3 木聚糖酶分離純化結果Table 3 The result of M-26 xylanase purification

2.6 M-26堿性木聚糖酶的酶學性質

2.6.1 M-26堿性木聚糖酶最適作用溫度及溫度穩定性在不同溫度條件下進行酶促反應，檢測木聚糖酶活力，結果見圖5。由圖5可知，木聚糖酶的最適反應溫度為55℃。將酶液在不同溫度條件下保溫20 min，檢測剩余木聚糖酶活力，未經處理酶活力為100，結果見圖6。50℃處理剩余酶活達95%以上，55℃處理剩余酶活為80%，60℃處理剩余酶活70%，65℃和70℃剩余酶活均為10%，說明此堿性木聚糖酶在60℃以下比較穩定。

圖5 木聚糖酶的最適溫度Fig.5 Effect of temperature on the activity of xylanase

圖6 木聚糖酶的溫度穩定性Fig.6 Temperature stability of xylanase

2.6.2 M-26堿性木聚糖酶最適作用pH及pH穩定性在不同pH值條件下進行酶促反應，測定酶活力，結果見圖7，木聚糖酶的最適反應pH為8.0。將粗酶液用不同pH緩沖液適當稀釋，4℃，放置24 h，測定其殘余酶活力。結果見圖8，酶液于pH 8.0下，幾乎沒有酶活損失;在pH 8.6下的殘余酶活力約50%;在pH 9.0下，殘余酶活力約40%;pH 9.6下，殘余酶活力不足10%;結果表明該木聚糖酶為堿性木聚糖酶，且具有一定的耐堿性。

圖7 木聚糖酶的最適作用pHFig.7 Effect of pH on the activity of xylanase

圖8 木聚糖酶的pH穩定性Fig.8 pH stability of xylanase

2.7 金屬離子對M-26堿性木聚糖酶活力的影響

不同金屬離子對木聚糖酶活性影響見表4，Fe2+對該酶有激活作用;Mg2+、Ca2+、Ba2+和Al3+對該酶的活性基本無影響;Mn2+對該酶的抑制力接近50%;Zn2+、Fe3+、Cu2+具有強烈抑制作用。

2.8 不同底物的專一性

將純化的堿性木聚糖酶加入到不同的底物中考察其底物專一性，由表5可知，經過純化的木聚糖酶對可溶性淀粉、CMC、纖維素均基本無親活力;而在用燕麥木聚糖和樺木木聚糖做底物時，該酶均具有較高的親活力，燕麥木聚糖這一組酶活性更高，說明M-26堿性木聚糖酶對燕麥木聚糖的親活力高于對樺木木聚糖的親活力，這一點正和分離菌種的樣品來源于造紙廠相吻合。

表4 金屬離子對M-26堿性木聚糖酶活的影響Table 4 Effect of metallic ion on M-26 xylanase activity

表5 M-26堿性木聚糖酶的底物專一性Table 5 Substrate specificity of M-26 xylanase

3 討論

從短小芽胞桿菌M-26的發酵液中分離純化的堿性木聚糖酶，無纖維素酶活性，用于紙漿預處理不會破壞纖維素，有益于紙漿生物漂白的應用。工業用M-26堿性木聚糖酶制劑制備工藝中鹽析硫酸銨的飽和度為50%，回收率為85%以上，成品酶活力可達9 000 IU/g。sephadexG-25脫鹽，純化倍數為11.93，酶的比活為75.77 IU/mg蛋白，回收率為36.33%;cellulose DE-52離子交換層析，純化倍數為19.89，酶的比活為126.32 IU/mg，回收率為36.33%;SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定其分子量約20.1～29 ku，主蛋白分子量20 100，次蛋白分子量29 000。酶的性質研究表明，酶作用的最適pH和溫度分別為8.0和55℃，在60℃以下比較穩定，具有一定的耐堿性，紙漿生物漂白應用條件試驗中的最適pH為9.6足以說明，因此短小芽胞桿菌M-26堿性木聚糖酶具有較好的開發潛力和應用前景。

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