蛋殼內膜分解菌的篩選、鑒定及其所產蛋白酶性質的初步研究

馬瑜，李勃*，肖明

(1.陜西省微生物研究所，陜西西安710043;2.西北大學附屬中學，陜西西安710069)

蛋殼內膜(eggshell membrane，ESM)是指蛋殼與蛋白之間的一層厚度約70 μm的生物膜，其中有機組分占70%，無機組分占10%，含水量約為20%;有機組分中主要包括一些不溶性的蛋白質，如膠原蛋白(Ⅰ型、Ⅴ型和Ⅹ型)、骨橋蛋白和骨唾液酸糖蛋白，以及少量的碳水化合物和脂質［1］。蛋殼內膜的骨架結構主要是由角蛋白和粘多糖通過角蛋白分子鏈間及鏈內高度的二硫鍵交聯形成內外2層緊密的纖維網狀蛋白［2］。因蛋殼內膜中富含的角蛋白及構成膠原蛋白的羥脯氨酸以及透明質酸、粘多糖等多種有機成分與人體皮膚密切相關［3］，所以在醫療衛生、化妝品、生物制藥以及輕工等領域都具有很大的應用價值［4］。但是由于蛋殼內膜特有的纖維網狀結構使其在自然條件下非常穩定，對于酸、堿以及蛋白酶都具有極好的耐受性，且不溶于水和多種溶劑，因而目前仍是一種無法有效利用的生物質資源［5］。隨著我國現代蛋制品加工業的不斷發展，在很大程度上改變了原來的蛋殼來源分散、不易收集的情況，但由于不能對其進行有效利用從而造成了資源的浪費，因此對蛋殼及蛋殼內膜資源化研究與開發具有重要的理論與實踐意義。本研究從土壤中分離篩選到1株能夠有效分解蛋殼內膜的細菌菌株Pes207，通過生理生化試驗以及16S rRNA的序列測定確定其為假單胞菌屬(Pseudomonas)的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。通過對其發酵產物的分離純化，從中分離到了一種能夠分解蛋殼內膜的蛋白酶，并對其酶學性質進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源土壤樣本取自日本兵庫縣、淡路島以及西安市周邊的農田、家禽養殖廠、家禽屠宰場區。

1.1.2 篩選培養基溶液A:KH2PO40.136 g，Na2HPO4·12H2O 0.68 g，NaCl 0.2 g，NH4NO30.2 g，酵母提取物0.05，蛋白胨1.0 g，ESM(蛋殼內膜)粉0.4 g，H2O 86 mL，pH 7.0;溶液B:MgSO4·7H2O 0.136 g，FeSO4·7H2O 0.68 g，MnSO4·4H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，H2O 14 mL，pH 7.0。蛋殼內膜的提取方法參照文獻［6］。將配制好的溶液A與溶液B加熱充分溶解后于室溫下冷卻至45℃左右按比例混合，并加入瓊脂粉1.5 g/100 mL，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種篩選及鑒定①菌種篩選:稱取土壤樣品1 g加入裝有99 mL無菌水的小三角瓶中，充分震蕩均勻，取100 μL懸液，將其滴加在由篩選培養基制備的9 cm培養皿上并用三角刮刀均勻涂布，涂布后的培養皿于37℃培養。培養1～2周，挑取產生明顯透明圈的菌落，進一步分離純化。將純化后的菌株進行液體發酵，并測定發酵液中ESM蛋白酶的活力;②菌種鑒定:菌株Pes207的形態觀察及理化測試參照文獻［7］進行。參照文獻［8］，根據原核生物16S rRNA的保守序列合成引物:Primer A:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3';PrimerH:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。PCR擴增反應條件:95℃2 min;95℃1 min，50℃2 min，72℃2.5 min，共35次循環;72℃延伸5 min。PCR擴增產物以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢查，并以QIAEX II Gel Extraction System(Qiagen)回收純化后交北京華大基因科技有限公司進行序列測定。采用DDBJ中FASTA程序比對所測DNA序列，并利用Clustalx 1.83及MEGEA 4.0軟件構建系統發育樹。

1.2.2 蛋白含量及酶活力測定①蛋白含量測定:使用Folin-酚試劑法［9］，于600 nm下測定溶液的光吸收并根據標準曲線計算蛋白含量;②酶活力測定:發酵液經離心去除菌體，取0.3 mL稀釋50倍的上清液置入0.8 mL 0.6%的酪蛋白溶液(pH 8.0)中，充分搖勻后迅速取出0.55 mL反應液置入含有0.5 mL 10%TCA的eppendorf管，并置于冰浴中終止反應;其余反應液于30℃水浴中反應1 h后加入0.5 mL 10%TCA終止反應，并于13 000 r/min，10 min，4℃條件下離心，取0.2 mL離心后的上清液置入2.5 mL Na2CO3-NaOH溶液中，30℃水浴10 min，加入0.2 mL Folin-酚試劑，反應30 min后于600 nm下檢測其吸光度值，并計算酶活力。酶活力定義:在pH 8.0，30℃條件下反應1 h使反應液在600 nm的光吸收增加1所需的酶量為1個酶活單位(U)。

1.2.3 酶的提取及純化①鹽析法提取粗酶:將發酵液于室溫下離心除去菌體及雜質后，提取上清液作為粗提酶液。將粗酶液進行40%硫酸銨飽和鹽析后取上清液，再進行80%硫酸銨飽和鹽析，離心后收集沉淀。將沉淀用少量0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)溶解并裝入透析帶，4℃下透析過夜;②離子交換柱層析:具體方法見文獻［10］。將透析后的酶液加入CM52(Cellulose CM52)層析柱，以0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)進行洗脫收集，并測定每管的蛋白含量及酶活力。合并活性最高的3管收集液，于4℃下用pH 8.0的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液透析過夜。將透析后的收集液加入DE52(DEAE Cellulose DE52)層析柱，以0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)進行洗脫，測定每管的蛋白含量及酶活力，合并有活性最高的6管收集液。

1.2.4 酶的分子量測定將經過二次離子交換層析所得酶液用SDS-PAGE凝膠電泳法檢驗其純化程度，并測定其分子量，具體方法見文獻［11］。

1.2.5 酶學性質研究①酶反應的最適溫度:在20～90℃范圍內，以10℃為增加量下測定該酶對酪蛋白的水解活性;②酶反應的最適pH:在30℃下，利用20 mmol/L的不同緩沖液:醋酸鈉緩沖液(pH 3.0～5.5)，磷酸鉀鈉緩沖液(pH 5.0～8.0)，Tris-鹽酸(pH 7.0～9.0)以及碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(pH 9.0～11.0)作為反應體系測定酶活力。在pH低于5.5條件下，以血紅蛋白代替酪蛋白作為反應底物;③溫度對酶穩定性的影響:將酶在20～90℃下處理10 min，在30℃下測定其殘余酶活力;④pH對酶穩定性的影響:pH 3.0～11.0范圍內，將酶溶于不同緩沖液(同②)中于4℃下過夜保存后，于30℃下測定其殘余酶活力;⑤酶的Km值測定:在pH 8.0，60℃的條件下以不同濃度(S)的酪蛋白為底物溶液，測定酶的反應速度V(以單位時間內吸光度的減少量dA/dt來表示)，以1/V-1/［S］的雙倒數法作圖，計算Km值。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選結果

通過篩選共發現4株菌株在以ESM為碳源的培養基上生長良好，其中分離自日本淡路島農田土壤的菌株Pes207對于ESM的分解效果最為顯著。如圖1所示，圖1A中的晶體樣片段為研磨后不溶于水的蛋殼內膜碎片，利用Pes207的發酵清液在30℃下處理48 h后，大部分晶體樣片段被徹底分解并液化，見圖1B。

圖1 蛋殼內膜被Pes207所產ESM蛋白酶分解的效果Fig.1 Decomposition of the eggshell membrane digest by the ESM protease from strian Pes207

2.2 菌株Pes207的生理生化鑒定

顯微鏡下觀察，Pes207菌體為桿狀，端生鞭毛，大小約0.8 μm×3.0 μm;不產生芽胞，革蘭染色呈陰性，專性好氧。在營養瓊脂平板上生長，菌落為微黃色，直徑約3～5 mm(見圖2)。該菌株的生理生化實驗結果見表1。

表1 菌株Pes207的生理生化實驗結果Table 1 Physiological and biochemical result of Strain Pes207

圖2 菌株Pes207的革蘭染色照片Fig.2 Photograph of Strain Pes207 by gram stain

2.3 菌株Pes207的分子生物學鑒定

經測定，菌株Pes207的16S rDNA PCR產物長度為1.5 kb左右。該序列已在DDBJ注冊，注冊號為AB507253。利用Clustal 1.83對菌株Pes207的16S rDNA序列和DDBJ中已登錄的16S rDNA序列進行同源性比較，對比結果發現菌株Pes207與多株惡臭假單胞菌(Psedumonas putida)的16S rDNA核苷酸序列的同源性均在99%以上，結合生理生化鑒定結果，可斷定菌株Pes207為假單胞菌屬(Psedumonas)的惡臭假單胞菌(Psedumonas putida)。利用MEGA 4構建的NJ法系統發育樹見圖3。

圖3 Pes207的N-J法系統發育樹Fig.3 The N-J Phylogenetic tree of strain Pes207

2.4 Pes207所產ESM蛋白酶的分離純化結果

圖4 ESM蛋白的離子交換層析圖Fig.4 Ion-exchange Chromatography curve of ESM protease

將Pes207的發酵液進行鹽析及二次離子交換層析后的結果見表2。其層析結果見圖4，經過二次離子交換層析后目標蛋白的相對酶活力增加了34倍，純化蛋白經SDS-PAGE電泳顯示為單一條帶(圖5)，經測定其分子量約32 ku。

表2 ESM蛋白酶分離純化結果Table 2 Separation and purification of ESM protease

圖5 ESM蛋白酶的SDS-PAGE電泳Fig.5 SDS-PAGE of ESM protease

2.5 Pes207所產ESM蛋白酶的基本性質

經測定，該蛋白酶的一些基本性質，如最適反應pH、最適反應溫度、熱穩定性，不同pH條件下的穩定性，以及Km值等如表3所示。

表3 純化后的Pes207所產ESM蛋白酶的性質Table 3 Characteristics of the purified ESM protase of Pes207

3 討論

隨著社會的不斷進步與發展，如何有效利用自然界中的生物質資源正在受到日益廣泛的重視。諸如甲殼素、殼聚糖、膠原蛋白等物質，由于其均取材于生物體自身合成的材料，對人體與動物具有一定的親和性，因此在醫用材料、制藥以及化妝品制造等領域具有較高的商業價值。另外，這些物質通常是從食品、農產品加工業的廢棄物中提取，因而成本低廉，不但具有開發價值同時有利于保護環境。

因其特殊的膜結構及水不容性，富含角蛋白及膠原蛋白等多種有機成分，蛋殼內膜成為近年來開始受到關注的又一種生物質資源。盡管有研究報道［12-13］利用蛋殼內膜作為吸附材料富集廢水中的重金屬離子取得了良好的效果，但由于其穩定的膜結構，難溶于水和有機溶劑，使得其應用仍然受到很大限制。如何有效分解蛋殼內膜，從中提取水溶性蛋白質或多肽并加以利用，是未來開發此類資源的關鍵所在。而利用微生物方法來降解蛋殼內膜相比化學法操作簡便、成本低廉，是實現其資源利用的一種有效手段［14-16］。

本研究從日本淡路島土壤中分離得到1株能夠直接分解并液化蛋殼內膜的菌株Pes207(Psedumonas putida，AB507253)，經研究發現該菌株能夠產生一種可直接分解蛋殼內膜的蛋白酶，通過二次飽和硫酸銨鹽析及二次離子交換層析的方法從其發酵液中純化出了該酶，經SDS-PAGE電泳測定其分子量約32 ku，同時對純化后的蛋白酶的基本性質作了初步研究，實驗結果表明該菌株所產蛋白酶為堿性蛋白酶類，在30～70℃，pH 5.5～9.0的條件下具有良好的穩定性，具有一定的開發潛力。下一步計劃對該酶蛋白的氨基酸序列以及其分解蛋殼內膜的產物進行分析，并進一步深入研究其酶學性質及作用機理。

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