1株海洋真菌ZH2.1的鑒定及生物學特性初步研究

雷曉凌，李學恭，佘志剛，蔡小玲，鐘敏，楊志娟

(1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524025;2.中山大學化學與化工學院，廣東廣州510275)

海洋無脊椎動物能在競爭異常激烈的生境中繁衍生息，主要依賴于自身擁有的強大化學防御機制。從海洋無脊椎動物組織里分離到的活性化合物，很多并非是這些無脊椎動物產生的，而是與其共生的海洋微生物產生的［1］。由于許多海洋天然產物在結構上與微生物天然產物極其相似，共附生于海洋無脊椎動物的微生物一直被認為是這些化合物真正的產生者［2］。近年來，從海洋環境中尋找微生物新種和具有特殊功能的生理活性物質，已成為國內外的研究熱點［3-5］。海洋真菌由于其次生代謝產物的化學多樣性豐富、產量高而成為海洋天然產物研究的一類重要生物資源［6-7］。菌株ZH2.1是從南海一種海魚消化道中分離得到的1株真菌，其發酵液對金黃色葡萄球菌有較強的抗性，并具有較強的抗腫瘤活性，本文通過傳統的形態學鑒定方法，并結合18S rDNA序列分析對其進行鑒定和生物學研究，為進一步研究該菌及其活性物質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株菌株ZH2.1分離自南海海域白姑魚，由廣東海洋大學食品科技學院實驗室保存。

1.1.2 試劑Taq聚合酶、dNTPs、瓊脂糖購自北京鼎國生物技術發展中心;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自AxyGEN公司;pMD18-T Vector購自TaKaRa公司;實驗中所用培養基均購自北京陸橋技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養基種類對菌株生長的影響在PDA平板、察氏平板和馬丁-孟加拉紅平板上分別點植菌株ZH2.1，28℃培養3～10 d，觀察菌落形態，顏色，產色素情況，表面滲出物情況。培養基均用海水配置，并添加抑菌劑。

1.2.2 形態學分類根據菌落外部形態及孢子器、孢子梗、孢子等的形狀，結合真菌鑒定手冊［8-9］初步判定其種屬。

1.2.318 S rDNA序列分析采用NS1:5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3';ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'為正反向引物(上海生工合成)，以CTAB法提取菌絲體的DNA。PCR反應體系為(25 μL):模板DNA 1.00 μL，10×PCR緩沖液2.50 μL，dNTPs(10 mmol/L)2.00 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.50 μL，Taq聚合酶(5 U/μL)0.30 μL，超純水18.20 μL。PCR擴增條件:94℃1 min;94℃30 s，57℃60 s，72℃90 s，72℃3 min，35個循環;10℃10 min。PCR產物回收，純化，目的DNA片段連接至pMD18-T載體，轉化JM 109感受態細胞，經質粒酶切鑒定，挑取陽性克隆子進行序列測定。DNA序列由上海生工生物工程技術有限公司測定，將測序得到18S rDNA序列通過Blast與GenBank中的核酸序列進行比對(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，利用Clustalx 8.0及Mega 4.0軟件構建系統發育樹，進行系統發育分析。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對菌株ZH2.1生長的影響

ZH2.1菌落在PDA培養基中生長較快，第5天菌落直徑達47 mm。如圖1所示，菌落最初為白色，漸變為粉紅色，菌落反面為褐色。菌落呈圓形，平坦，后變為絮狀，邊緣產淡黃色色素。菌株在以海水配置的PDA培養基、察氏培養基及馬丁-孟加拉紅培養基中生長情況有較大差異(表1)。

圖1 菌株ZH2.1在PDA培養基上的菌落形態Fig.1 The colony morphology of strain ZH2.1 on PDA medium

表1 菌株ZH2.1在不同培養基上的生長特征Table 1 Culture characteristics of strain ZH2.1 on different media

2.2 顯微形態特征

培養7～15 d，光學顯微鏡下觀察，菌絲無橫隔，分支。分生孢子器燒瓶形，有孔口，壁厚，如圖2。孢子卵圓形，有橫隔。菌絲形成厚垣孢子，近似圓形，串生。

2.3 菌株ZH2.1的分子鑒定及系統發育關系

2.3.1 菌株ZH2.1 DNA提取及PCR擴增提取菌株ZH2.1的DNA并作為模板，以NS1/ITS4作為引物進行18S rDNA擴增，擴增的片段為2 301 bp，見圖3。

圖2 菌株ZH2.1產孢器形態(15×40)Fig.2 Pycnidium morphology of strain ZH2.1 on PDA medium(15×40)

2.3.2 菌株ZH2.1系統發育分析以基因組DNA為模板，NS1/ITS4作為引物，PCR擴增得到的菌株ZH2.1的18S rDNA序列全長為2 301 bp，該序列已提交GenBank注冊，登錄號為FJ450059。將該序列與GenBank數據庫中已收錄的真菌18S rDNA進行Blast分析，結果表明，菌株ZH2.1的18S rDNA序列與莖點霉屬的菌株相似性較高，根據同源性高低順序，選擇其中相似性較高的15株菌的18S rDNA序列，用ClustalX 1.8與Mega4.0軟件構建系統發育樹。由圖4可知，菌株ZH2.1與孔狀短小莖點霉Phoma exigua var.exigua(EU167567)處于同一分支，親緣關系最近，相似性達到98%。綜合形態學觀察，培養特性及18S rDNA序列分析，初步鑒定菌株ZH2.1為孔狀短小莖點霉。

圖3 菌株ZH2.1的18S rDNA PCR擴增結果Fig.3 PCR products of strain ZH2.1 18S rDNA

圖4 基于菌株ZH2.1的18S rDNA與相關菌種的系統發育進化樹Fig.4 The phylogenetic tree of the 18S rDNA of ZH2.1 and the relative strains

2.3.3 NaCl濃度對菌株ZH2.1生長的影響在PDA培養基中添加不同濃度的NaCl，經過培養后，發現菌株ZH2.1在不同濃度NaCl環境中生長情況差異較大，見表2。說明菌落大小和色素的產生與NaCl含量有關;不過NaCl含量對其發酵液的抗菌活性影響不大。

表2 NaCl濃度對菌株ZH2.1生長特性的影響Table 2 Effect of different concentration NaCl on the culture characteristics of ZH2.1

3 討論

真菌的分類鑒定往往以傳統的形態學特征為主，但是真菌形態特征復雜，而且環境的變化對真菌的形態特征影響較大，這可能導致分類系統的不穩定，給分類鑒定工作帶來不便。核酸序列特異性較強而且穩定，即不同親緣關系的物種核酸序列差異較大，真菌基因組中編碼核糖體的基因包括4種:28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA。它們在染色體上頭尾相連、串聯排列，相互之間由間隔區分隔。它們有不同的進化程度，有的序列比較保守，有的序列進化較快，因此可以根據它們的序列對真菌進行準確的鑒定。

在傳統的鑒定方法基礎上，進一步通過18S rDNA序列分析構建系統發育關系，可以準確有效地鑒定真菌。本文通過對分離自南海海域海魚消化道的真菌ZH2.1進行鑒定，綜合菌落形態特征、菌體顯微特征和18S rDNA序列分析結果，初步鑒定該菌為孔狀短小莖點霉。此外，通過耐鹽性分析，菌株ZH2.1可以耐受較高的NaCl濃度，最高NaCl耐受濃度達15%，而且也可以在無NaCl的培養基中生長，表明菌株ZH2.1是非專一性的海洋真菌。

菌株ZH2.1分離自海魚的消化道，而目前國內外有關莖點霉屬的研究幾乎都來自植物病原菌［10-12］，海洋真菌也僅見紅樹林內生真菌［13］，未見有從動物中分離到莖點霉屬的報道，可能該菌是源于海魚的餌料。

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