沼澤生紅冬孢酵母生長及產類胡蘿卜素培養條件的研究

楊世平，吳灶和，簡紀常

(1.廣東海洋大學廣東省海洋開發研究中心，廣東湛江524025;2.廣東海洋大學水產學院，廣東湛江524025;3.廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東湛江524025)

類胡蘿卜素是一類多烯類化合物，呈黃色或紅色，因為可以轉化為維生素A，并具有著色、抗氧化和抗癌等作用，被廣泛用于制藥、化學、食品和飼料工業等方面。動物不能合成類胡蘿卜素，只能從食物中獲取［1］。某些植物、藻類、細菌和真菌(包括酵母)可以產生類胡蘿卜素。能產生類胡蘿卜素的酵母主要有紅酵母屬(Rhodotorula)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)和擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的一些種類，其主要色素包括β-胡蘿卜素(β-carotene)、圓酵母素(torulene)、紅酵母紅素(torularhodin)和蝦青素(astaxanthin)［2］。紅酵母還含有豐富的蛋白質、氨基酸、不飽和脂肪酸、糖類和維生素等各種生理活性物質，是水產經濟動物優良的天然餌料［3］，并已經被用于促進生長［4］、改善腸道微生物結構［5］、改變水產養殖動物的體色［6］和降低水產動物的氧化壓力［7］等方面。近年來已有廠家開始生產紅酵母，并用于飼料添加劑中［4］。紅酵母對營養要求不高，可以利用一些農業原材料作為培養基，包括水解綠豆廢粉、糖蜜和玉米漿等進行培養，這也利于紅酵母的大規模培養和應用推廣。實驗菌株為湛江對蝦養殖區海水中分離、篩選的沼澤生紅冬孢酵母(Rhodosporidium paludigenum)，實驗證明該菌株在對蝦腸道具有一定黏附能力，能顯著提高凡納濱對蝦生長率、存活率以及對蝦肝胰腺和血清中部分抗氧化酶活力，降低對蝦的抗氧化壓力［8］。本文研究了其生長和產類胡蘿卜素的培養條件，為沼澤生紅冬孢酵母的大規模培養和進一步在水產養殖中開發利用提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株沼澤生紅冬孢酵母(R.paludigenum)為本實驗室從湛江對蝦養殖區海水中分離、篩選的菌株。在麥芽汁平板上培養1～2 d，生長出紅色小菌落，菌落直徑約為2～5 mm。菌落表面光滑，有光澤，質地黏稠，邊沿較為整齊。細胞形態為球形或橢圓形，單個或多個細胞相連。

1.1.2 培養基活化培養基(YPD，%):酵母膏1.0，蛋白胨2.0，葡萄糖2.0，瓊脂2.0，pH 6.0;發酵培養基(%):葡萄糖2.5，酵母膏1.0，MgSO4·7H2O 0.01，K2HPO40.2，KH2PO40.2，pH 6.0［9］。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養將菌種接種在YPD固體培養基上活化，28℃培養48 h，接種于裝有發酵培養基的三角瓶中，裝液量為50 mL/250 mL，28℃150 r/min，培養48 h作為種子液;再以10%接種量接入相應的培養基中，相同培養條件培養72 h，發酵結束后經離心收集菌體并測定生物量和類胡蘿卜素含量，計算單位體積發酵液的生物量和類胡蘿卜素產量，確定發酵條件。

1.2.2 單因素實驗分別進行不同碳源、氮源、鹽度、pH值、溫度、裝液量、接種量和搖床轉速對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響實驗。以發酵培養基為基礎，改變相應的培養基組成和培養條件進行實驗，各設3個重復。

1.2.3 正交實驗培養基優化采用3因素3水平L9(33)正交實驗，共設有9個處理，每個處理設3個重復。根據單因素實驗的結果，選擇葡萄糖、牛肉膏和酵母膏作正交實驗，最后篩選出優化組合。

1.2.4 細胞生物量測定將培養液以4 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用蒸餾水清洗2次，所得菌體置于65℃烘箱中干燥至恒重，稱重。

1.2.5 類胡蘿卜素的測定二甲基亞砜法［10］。

1.2.6 數據處理和統計分析單因素實驗結果采用SPSS11.5軟件進行數據處理和統計分析，Duncan檢驗法進行均值間多重比較(以P＜0.05作為差異顯著水平)，并在圖中進行標注(同一柱形圖中相同圖案條形柱上字母不同表示差異顯著)。正交實驗結果采用正交設計助手Ⅱ(V3.1)軟件進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響

圖1 不同碳源對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響Fig.1 Effects of carbon sources on growth and production of carotenoid by R.paludigenum

分別以2.5%葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉和紅糖為碳源，進行發酵培養。由圖1可見，碳源對沼澤生紅冬孢酵母的生物量及類胡蘿卜素產量都有顯著的影響(P＜0.05)。以蔗糖為碳源時，生物量最高，但其類胡蘿卜素產量卻顯著低于葡萄糖和紅糖作為碳源時的產量。以葡萄糖為碳源時，類胡蘿卜素產量最高，與Bhosale等［9］對粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)培養條件的研究結果相似，因此，本實驗選擇葡萄糖作為沼澤生紅冬孢酵母發酵時的碳源。以紅糖為碳源時，仍能取得較大的生物量及類胡蘿卜素產量，加上紅糖價格較低，大規模生產和應用可以利用紅糖作為碳源。

2.2 不同氮源對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響

在總含氮量相同情況下，分別以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸銨和硝酸鈉為氮源進行不同氮源對生物量和類胡蘿卜素的影響實驗。為了保證生物素等微量成分的供應，培養基中均額外增加了0.5%的酵母膏。由圖2可見，氮源對沼澤生紅冬孢酵母的生物量及類胡蘿卜素產量都有顯著的影響(P＜0.05)，最利于類胡蘿卜素合成的氮源是牛肉膏，其次是蛋白胨，與孫乃霞等［11］培養法夫酵母(Phaffia rhodozyma)的研究結果相同。同時發現有機氮要比無機氮更利于紅酵母類胡蘿卜素的積累，與有關報道結果相似［12］。

圖2 不同氮源對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響Fig.2 Effects of nitrogen sources on growth and production of carotenoid by R.paludigenum

2.3 起始pH值對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響

pH值能夠影響微生物對營養物質的吸收、利用和代謝產物的分泌，也影響微生物所產生的酶種類和活力，使代謝途徑和細胞膜的通透性發生變化［13］。由圖3可見，起始pH對沼澤生紅冬孢酵母的生物量和類胡蘿卜素產量有顯著影響(P＜0.05)，當起始pH值為6.3時生物量和類胡蘿卜素產量最高，因此，沼澤生紅冬孢酵母發酵的最適初始pH值為6.3左右。

圖3 起始pH值對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響Fig.3 Effects of initial pH values on growth and production of carotenoid by R.paludigenum

2.4 裝液量對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響

圖4 裝液量對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響Fig.4 Effects of volumes on growth and production of carotenoid by R.paludigenum

裝液量可以影響培養基中溶氧的濃度，從而影響紅酵母的生長和類胡蘿卜素的生產。在250 mL三角瓶中分別裝入不同體積的發酵培養基，進行發酵實驗。結果見圖4，裝液量對沼澤生紅冬孢酵母的生物量和類胡蘿卜素產量都有顯著的影響(P＜0.05)，且其生物量及類胡蘿卜素產量都隨裝液量的增加而降低。對類胡蘿卜素來說，裝液量為50 mL/250 mL時，每瓶每培養1次的類胡蘿卜素產量最高，為0.13 mg。

2.5 搖床轉速對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響

搖床轉速可以影響培養基中溶氧的濃度，從而影響沼澤生紅冬孢酵母的生長和類胡蘿卜素的生產。但培養基中溶解氧濃度有上限值，達到這個值后搖床轉速繼續增加，溶解氧也不會增加，且搖床轉速過快，產生的剪切力也將增大，影響菌體的生長，甚至使細胞破碎死亡［14］。實驗結果見圖5，轉速為170 r/min時，可以得到最大的生物量和類胡蘿卜素產量。

圖5 搖床轉速對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響Fig.5 Effects of rotating speed on growth and production of carotenoid by R.paludigenum

2.6 NaCl對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響

本實驗的沼澤生紅冬孢酵母是從海水中分離得到的，也將應用到海水養殖中去。根據海洋環境的特點，研究了不同濃度的NaCl對其生物量及類胡蘿卜素產量的影響。由圖6可見，NaCl對其生物量及類胡蘿卜素產量有顯著影響(P＜0.05)。當NaCl濃度在10 g/L時，沼澤生紅冬孢酵母的生物量及類胡蘿卜素產量最高，這與張志軍等［15］研究海洋紅酵母(Rhodotorula sp.)時的結果相似。當NaCl濃度在10～40 g/L的范圍內時，隨NaCl濃度的增加其生物量和類胡蘿卜素產量不斷下降，說明高濃度的NaCl抑制了細胞生長和類胡蘿卜素的積累。但當NaCl濃度為40 g/L時，其生物量和類胡蘿卜素產量仍分別為NaCl濃度為10 g/L時的81.1%和92.4%，說明其對鹽度有一定的耐受能力。

圖6 NaCl對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響Fig.6 Effects of NaCl on growth and production of carotenoid by R.paludigenum

2.7 培養溫度對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響

圖7 培養溫度對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響Fig.7 Effects of temperature on growth and production of carotenoid by R.paludigenum

培養溫度是影響酵母生長和類胡蘿卜素積累的重要因素之一。由圖7可看出，溫度對沼澤生紅冬孢酵母的生物量和類胡蘿卜素產量有顯著的影響(P＜0.05)。當培養溫度為28℃時，其類胡蘿卜素產量最高。當培養溫度為22℃時，其生物量和類胡蘿卜素產量最低，分別是培養溫度為28℃時的96%和87%，說明沼澤生紅冬孢酵母對溫度的適應范圍也較廣。

2.8 不同接種量對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響

不同接種量對沼澤生紅冬孢酵母生物量和類胡蘿卜素產量仍有顯著的影響(P＜0.05)，以10%的接種量最佳。

圖8 接種量對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素的影響Fig.8 Effects of inoculum size on growth and production of carotenoid by R.paludigenum

2.9 正交實驗結果

單因素實驗結果來看，沼澤生紅冬孢酵母產類胡蘿卜素的最優碳源是葡萄糖，氮源是牛肉膏。為了保證生物素等微量成分的供應，培養基中特別添加了酵母膏，并以這3種培養基成分作為正交實驗的3個因素，每個因素選3個水平，如表1所示，進行正交實驗。由表2可知，影響沼澤生紅冬孢酵母生物量的因素主次順序為ACB，即葡萄糖含量對其生物量的影響最大，酵母膏次之;而影響其類胡蘿卜素產量的因素主次順序為BAC。為獲得較高的生物量和類胡蘿卜素產量，選擇A2B1C2，即葡萄糖40 g/L，牛肉膏為10 g/L，酵母膏10 g/L為沼澤生紅冬孢酵母培養的最優組合。

表1 正交實驗因素水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

表2 正交實驗結果和極差分析表Table 2 Results and intuitive analysis of orthogonal experimental design

3 結論

對沼澤生紅冬孢酵母生長和產類胡蘿卜素培養條件的單因素實驗表明，各因素的最優條件如下:葡萄糖為碳源，牛肉膏為氮源，NaCl為10 g/L，培養溫度為28℃，初始pH為6.3，搖床轉速為170 r/min，裝液量為50 mL/250 mL，接種量為10%。實驗結果表明，沼澤生紅冬孢酵母對pH、溫度和鹽度均有較廣的耐受范圍，有利于大規模培養和應用。正交實驗表明，影響沼澤生紅冬孢酵母生物量的因素主次順序為:葡萄糖＞酵母膏＞牛肉膏，而影響其類胡蘿卜素產量的因素主次順序為牛肉膏＞葡萄糖＞酵母膏。為獲得較高的生物量和類胡蘿卜素產量，選擇A2B1C2，即葡萄糖40 g/L，牛肉膏為10 g/L，酵母膏10 g/L為沼澤生紅冬孢酵母培養的最優組合。

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