HPLC法測(cè)定煙草及煙草制品中馬來(lái)酰肼殘留

張洪非，邊照陽(yáng)，唐綱嶺，胡清源

中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào)450001

馬來(lái)酰肼（MH）又稱抑芽丹，化學(xué)名6-羥基-2H-噠嗪-3-酮［1］，純品為白色結(jié)晶粉末，大鼠急性經(jīng)口LD50＞5000 mg/kg［2］，是一種煙草抑芽劑。1980年，ISO頒布了分光光度法測(cè)定煙草和煙草制品中的MH殘留量標(biāo)準(zhǔn)［3］。1991年，Yang［4］用膠束液相色譜法（MLC）測(cè)定了煙草中的MH殘留量，同時(shí)還比較了幾種前處理方法的優(yōu)缺點(diǎn)。1992年，Renaud等［5］采用衍生化-GC法分析了烤煙中的MH殘留量。1996年，John Lewis等［6］和1999年Dias等［7］先后采用HPLC法分析了馬鈴薯中的MH。Kubilius等［8-9］采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定了土豆和洋蔥中的MH殘留。Cho［10］采用毛細(xì)管電泳法研究了蔬菜和水果中的MH殘留。裴明黎等［11］、楊昀等［12］采用HPLC法分別測(cè)定了馬鈴薯、煙葉和土壤中的MH，但后者方法的檢出限較高，不能滿足MH的檢測(cè)需要［13］。GB/T 19611—2004也規(guī)定采用分光光度法測(cè)定煙草和煙草制品中的MH［14］。然而，此標(biāo)準(zhǔn)前處理繁瑣，每人每天僅能分析5～7個(gè)樣品，因此，進(jìn)行了本研究，目的是建立一種快速測(cè)定煙草及煙草制品中馬來(lái)酰肼殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 1200效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），配置VWD紫外檢測(cè)器；Milli-Q50超純水處理儀（美國(guó)Millipoer公司）；PHS-3C型精密pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；ZNHW電加熱套（河南豫華儀器有限公司）；Suplco C18固相萃取小柱（美國(guó)Suplco公司）；AE 163電子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler公司）。

馬來(lái)酰肼（97.5%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）；冰乙酸、醋酸銨（HPLC級(jí)，美國(guó)Tedia公司）；超純水（電阻率18 MΩ·cm）；2009年進(jìn)口津巴布韋烤煙煙葉L1MF樣品（2009年國(guó)家局煙草農(nóng)藥殘留普查分析樣品）。

1.2 樣品處理與分析

準(zhǔn)確稱取5.00 g 40目煙末，置于250 mL磨口圓底燒瓶中，加入50 mL 4 mol/L鹽酸，將圓底燒瓶放入電加熱套中加熱回流1 h，待回流完畢，冷卻至室溫，過(guò)濾，用4 mol/L鹽酸淋洗冷凝管和萃取過(guò)的煙末，合并濾液和淋洗液至100 mL容量瓶中，用4 mol/L鹽酸定容。準(zhǔn)確移取2 mL煙末處理液，傾入預(yù)處理（依次用2 mL甲醇和2 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉水溶液淋洗）過(guò)的C18固相萃取小柱中，接收流出液，用2 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉水溶液洗脫［6］，收集洗脫液，合并流出液和洗脫液，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液定容至5 mL，過(guò)0.45 μm水相濾膜，濾液取樣進(jìn)行HPLC分析。采用比較標(biāo)樣保留時(shí)間法定性，采用外標(biāo)法定量。分析條件為：

色譜柱：Varian Microsorb-MV 100-5 C18（250 mm×4.6 mm）柱；流動(dòng)相：0.1 mol/L（pH4.8）醋酸水溶液；等度洗脫；流速：0.7 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：313 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取溶劑和萃取方式的選擇

為選擇適宜的萃取溶劑，考察了甲醇、酸化甲醇（100體積80%甲醇＋1體積4 mol/L鹽酸），以及1，2，3，4，5，6和7 mol/L鹽酸作萃取溶劑［11-13］時(shí)MH的回收率，結(jié)果甲醇、酸化甲醇和1，2，3，4，5，6和7 mol/L鹽酸的萃取回收率分別為45.68%，54.23%，77.58%，85.64%，89.92%，94.02%，93.69%，93.54%和92.87%。由此可以看出，當(dāng)鹽酸濃度為4 mol/L時(shí)萃取回收率達(dá)到穩(wěn)定，隨著鹽酸濃度的升高，回收率并沒有明顯的升高；不同濃度鹽酸的回收率均高于甲醇和酸化甲醇，可能是因?yàn)镸H在煙葉中主要以自由態(tài)和結(jié)合態(tài)存在［4］，而甲醇只能提取煙葉中自由態(tài)的MH，酸化甲醇能提取煙葉中自由態(tài)和部分結(jié)合態(tài)的MH，而鹽酸溶液則能使煙葉中結(jié)合態(tài)的MH水解，從而提高了回收率。因此，選用4 mol/L鹽酸作為MH的萃取溶劑。

MH的萃取方式有超聲和加熱回流2種方式［4，11］，為了提高煙葉中MH的萃取效率，以4 mol/L鹽酸作萃取溶劑，考察了振蕩、超聲、微波和加熱回流萃取的回收率。結(jié)果表明，振蕩、超聲法、微波和加熱回流萃取的回收率分別為25.12%，30.52%，38.17%和94.02%；這表明振蕩、超聲和微波法不能有效地萃取樣品中的MH，而加熱回流的萃取方式則可以有效地萃取樣品中殘留的MH。

同理，考察了不同萃取溫度和萃取時(shí)間對(duì)萃取回收率的影響，結(jié)果見表1。從表1可以看出，180℃下萃取1 h的萃取回收率較高，且重復(fù)性較好。故選擇180℃下萃取1 h。

2.2 固相萃取小柱的選擇

分別考察了Suplco，Agilent，Waters和AgelaC18固相萃取小柱［4，11］對(duì)樣品萃取液的凈化效果及其固相萃取的回收率，結(jié)果Suplco，Agilent，Waters和Agela C18固相萃取小柱的回收率分別為96.34%，60.48%，66.21%和65.24%。由此可以看出，在考察的4種固相萃取小柱中，Suplco C18小柱的回收率最高，可以滿足在對(duì)樣品凈化的同時(shí)而不吸附目標(biāo)物的效果。因此，選擇Suplco C18小柱作固相萃取凈化柱。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

對(duì)文獻(xiàn)［6-7，11-12］中報(bào)道的檢測(cè)波長(zhǎng)205，220，236，313 nm進(jìn)行了比較，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為313 nm時(shí)響應(yīng)最高。因此，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)313 nm。

2.3.2 色譜柱

為達(dá)到較好的分離效果，分別考察了Eclipse XDS C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），Eclipse XDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agela XDB C1（84.6 mm×250 mm，5 μm），Varian Omnispher C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Varian Microsorb-MV 100-5 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱作色譜柱的分離效率，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，在以0.1 mol/L（pH4.8）醋酸水溶液作流動(dòng)相條件下，唯有Varian Microsorb-MV 100-5 C18柱可以將MH和雜質(zhì)峰有效分離，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)MH的定性和定量分析。因此，選擇Varian Microsorb-MV 100-5 C18柱作分離MH的色譜柱，在此條件下，MH的保留時(shí)間為7.789 min。

圖1 不同波長(zhǎng)下MH響應(yīng)

2.3.3 流動(dòng)相

為選擇適宜的流動(dòng)相，以Varian Microsorb-MV 100-5 C18柱作色譜柱，分別考察了乙腈∶水（體積比10∶90）［11］、甲醇∶水（體積比10∶90，pH2.7）［11］、甲醇∶水（體積比3∶97，pH2.7）［12］和0.1 mol/L（pH4.8）醋酸水溶液［6］作流動(dòng)相煙草樣品液中MH的分離情況，結(jié)果如圖3所示。由此可見，前3種流動(dòng)相，MH的峰均不能與雜質(zhì)峰基線分離，0.1 mol/L醋酸水溶液作流動(dòng)相可以使MH峰和雜質(zhì)峰達(dá)到基線有效分離，可以準(zhǔn)確定性定量；因此，選擇0.1 mol/L醋酸水溶液作流動(dòng)相。

2.4 工作曲線、檢出限、定量限、回收率和重復(fù)性

準(zhǔn)確稱取0.0100 g MH標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，用超純水溶解、定容，得100 μg/mL MH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；移取0.01，0.02，0.05，0.1，0.5，1.0，4.0和8.0 mL MH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別置于10 mL容量瓶中，用超純水稀釋定容，得0.1，0.2，0.5，1.0，5.0，10.0，40.0和80.0 μg/mL濃度的MH標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按濃度由低至高的順序分別對(duì)MH標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行HPLC分析，并以MH的峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性方程為Y=20.128X-0.07，相關(guān)系數(shù)1.000。以3倍信噪比計(jì)算檢出限，10倍信噪比計(jì)算定量限，則方法的檢出限為0.33 μg/g，定量限為1.0 μg/g。

在不含MH的樣品中分別加入8，80和160 μg/g 3個(gè)濃度水平MH標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個(gè)水平加標(biāo)6次，而后采用本方法測(cè)定其MH含量，并根據(jù)MH加標(biāo)量和測(cè)定量計(jì)算其回收率，結(jié)果見表2。由此可以看出，在不同添加濃度下MH的回收率在96.64%～98.02%之間，RSD在5.16%～9.35%之間，說(shuō)明本方法的準(zhǔn)確性較高，重復(fù)性較好，可以滿足農(nóng)藥殘留分析的要求［13］。

圖2 煙草樣品處理液5根柱子的分離色譜圖

表2 不同濃度MH加標(biāo)回收率和重復(fù)性（n=6）

圖3 煙草樣品處理液4種流動(dòng)相的MH分離色譜圖

2.5 與國(guó)標(biāo)方法測(cè)定結(jié)果比較

采用本方法和GB/T 19611—2004規(guī)定的紫外分光光度法測(cè)定了2007年煙草農(nóng)殘普查中檢出MH的23個(gè)樣品中的MH殘留量，結(jié)果見表3。對(duì)表3中數(shù)據(jù)作配對(duì)t檢驗(yàn)，在置信水平95%時(shí)，顯著性水平為0.05，概率P＝0.000，小于0.05，拒絕零假設(shè)，可以認(rèn)為本法測(cè)定的結(jié)果與國(guó)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果較為一致，二者不存在顯著性差異。相對(duì)于國(guó)標(biāo)法，本法測(cè)定更快，前處理更簡(jiǎn)單，每人每天能分析15～20個(gè)樣品，約為國(guó)標(biāo)法日處理量的3倍，提高了工作效率。

3 結(jié)論

采用加熱回流萃取、固相萃取凈化、HPLC法檢測(cè)煙草及煙草制品中MH殘留的方法，測(cè)定數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，重復(fù)性好，每人每天能分析15～20個(gè)樣品，適用于批量煙草樣品中MH殘留的快速檢測(cè)。

表3 本方法與國(guó)標(biāo)法測(cè)定的部分煙草樣品中MH殘留量（μg/g）

［1］王振榮，李布青.農(nóng)藥商品大全［M］.北京：中國(guó)商業(yè)出版社，1996.

［2］雷永和，李天飛.煙用化肥與農(nóng)藥［M］.昆明：云南科技出版社，1998.

［3］ISO 4876—1980 Tobacco and tobacco products-determination of maleic hydrazide residues［S］.

［4］Yang S S.Determination of maleic hydrazide in tobacco by micellar liquid chromatography［J］.J Chromatogr A，1992，595（1-2）：346-350.

［5］Renaud J M，Keller I，Vuillaume G..Determination of maleic hydrazide residues in cured tobacco by gas chromatography［J］.J Chromatogr A，1992，604（2-3）：243-246.

［6］John Lewis D，Barnes A，Wilkinson K，et al.Extraction of maleichydrazideresiduesfrompotatocrispsandtheir determinationusinghigh-performanceliquidchromatography with UV and atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometric detection［J］.J Chromatogr A，1996，750（1-2）：391-396.

［7］Dias A I，Duncan H J.Residues of free and bound maleic hydrazide in potato tubers［J］.Potato Res，1999，42（1）：89-93.

［8］Kubilius D T，Bushway R J.Determination of maleic hydrazide in potatoes and onions by capillary electrophoresis［J］.J Liq Chromatogr Rel Technol，1999，22（4）：593-601.

［9］Kubilius D T，Bushway R J.Determination of maleic hydrazide in pesticide formulations by capillary electrophoresis［J］.J AOAC Int，1998，81（6）：1109-1111.

［10］Cho R.Rapid analysis of maleic hydrazide in vegetables and fruits using capillary electrophoresis［J］.J Food Hyg Soc Jpn，2000，41（1）：74-78.

［11］裴明黎，蔣振輝，王秋霜，等.馬鈴薯中馬來(lái)酰肼的高效液相色譜法測(cè)定［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2009，28：611-616.

［12］楊昀，劉玉林.煙葉和土壤中抑芽丹殘留分析方法及應(yīng)用研究［J］.分析化學(xué)，2004，32：410-410.

［13］全國(guó)農(nóng)藥殘留實(shí)驗(yàn)研究協(xié)作組.農(nóng)藥殘留限量實(shí)用檢測(cè)方法手冊(cè)（第二卷）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001.

［14］GB/T 19611—2004煙草及煙草制品抑芽丹殘留量的測(cè)定紫外分光光度法［S］.