SPE-LC/MS/MS法同時測定煙葉中5種新煙堿類殺蟲劑殘留

何慶，徐迎波，王程輝，田振鋒，朱棟梁

安徽中煙工業公司技術中心，合肥市高新區天達路9號230088

新煙堿類殺蟲劑是一類高效、安全、高選擇性的新型殺蟲劑，作為后突觸煙堿乙酰膽堿受體（nAChRs）的激動劑作用于昆蟲中樞神經系統［1］，具有高殺蟲活性，而對哺乳動物低毒，在國內外市場的銷量發展很快。據預測，今后5年內，新煙堿類殺蟲劑將占全球農藥總量的15%～20%。其中，“烯啶蟲胺”、“吡蟲啉”和“啶蟲咪”（圖1）均是1990s年代日本開發出來的，目前國內已有企業生產。而“噻蟲啉”和“噻蟲嗪”自2001年注冊使用，目前均在專利保護期內。此類殺蟲劑單一殘留量的檢測方法已有報道，如Navalon等［2］采用GC/MS測定蔬菜殘留“吡蟲啉”，Tokieda等［3］利用GC連接電子捕獲檢測器檢測“啶蟲咪”含量。采用GC方法均會涉及到水解或者氧化的前處理過程，實驗較為繁瑣。Sasaki等［4］指出，由于基質效應的存在，利用GC檢測農藥殘留往往會得到過高的結果。人們逐漸發現，液相色譜（LC）法更適合于此類殺蟲劑的檢測，如Fernandez-Alba等［5］采用HPLC-UV測定蔬果中“吡蟲啉”殘留，并用LC-MS證實了其準確性，韓振泰等［6］利用反向HPLC測定了“噻蟲啉”殘留，此方法也被用于“噻蟲嗪”含量的檢測［7-8］。然而，這些方法均需要二氯甲烷或者氯仿為萃取溶劑，對環境不友好。因此，進行了本研究，旨在建立一種同時檢測煙草中5種新煙堿類殺蟲劑（圖1）殘留的方法，也為其他食品中此類殺蟲劑的檢測提供參考。

圖15 種新煙堿類殺蟲劑結構式

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；醋酸銨（AR，上海試劑廠）；超純水；“啶蟲咪”標樣（純度99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；“烯啶蟲胺”、“吡蟲啉”、“噻蟲嗪”、“噻蟲啉”（標樣，純度99.5%，美國AccuStandard公司）；無農藥殘留的空白煙葉樣品（取自中國科學技術大學煙草實驗基地溫室中以蛭石為基質的盆缽中種植的K326煙株）。

4000 Q Trap質譜儀（美國應用生物系統公司）；Waters Acquity超高壓液相色譜儀（UPLC，美國Waters公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；RE-2000旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；JK-250B超聲波清洗器（合肥金尼克機械制造有限公司）；Cleanert Pesticarb SPE柱（500 mg/6 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司）；Supelclean Envi-18 SPE柱、Supelclean Envi-Chrom P SPE柱（500 mg/6 mL，美國Supelco公司）；SampliQ Silica SPE柱（500 mg/6 mL，美國Agilent公司）；AL204-IC電子天平（感量：0.0001 g，瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 樣品處理［9］與分析［10］

準確稱取5.0 g煙末樣品，置于50 mL三角瓶中，加入20 mL 20%甲醇水溶液，室溫下超聲萃取10 min，過濾，用5 mL 20%甲醇水溶液洗滌濾渣和濾紙，液洗滌與濾液合并，共25 mL。取10 mL濾液，傾入Cleanert Pesticarb SPE柱上，緩慢施壓逐滴滴下，流盡后，流出液舍棄，用30 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，40℃，9.81 kPa下旋蒸至近干，N2吹干，用無水甲醇溶解并定容至1 mL，過0.22 μm微孔濾膜，濾液進行LC-MS/MS分析。采用比較與標樣色譜峰保留時間定性，外標工作曲線定量。測定條件為：

色譜柱：Waters Acquity UPLC Ben C18柱（2.1 mm×50 mm i.d.，1.7 μm d.f.）；柱溫：25℃；流動相：甲醇（A）和0.1%醋酸銨水溶液（B）；流速：0.6 mL/min；梯度洗脫：5%A+95%（0～3 min），40%A+60%B（3～10 min），60%A+40%B（10～15 min），100%A（15～20 min）；進樣量：10μL。

電離模式：電噴霧（ESI）正離子模式；電噴霧電壓：3000 V；檢測模式：多反應監測模式（MRM，表1）；離子源溫度：550℃；掃描時間：100 ms。

2 結果與討論

2.1 SPE條件的選擇

固相萃取（SPE）被廣泛應用于農藥及其共萃物的分離［11-12］。以往的SPE方法中，一般先用水溶性溶劑萃取，萃取液濃縮后再進行SPE，較為費時。Carbras。等［13］分析低酒精含量的溶液如白酒中的殺蟲劑時，建立了一種樣品不經濃縮直接SPE的方法。這也表明，如果SPE柱對被分析物的吸附能力足夠大，只要在萃取溶劑中降低有機溶劑的含量，就可以在保證萃取效率的同時，增大SPE柱對這5種殺蟲劑的保留能力，然后利用強極性溶劑將其洗脫［14］，這樣可以省去萃取液濃縮步驟，直接上樣。基于此種考慮，本研究比較了不同甲醇濃度水溶液的萃取效率，萃取液不經過濃縮，直接進行SPE，通過5種殺蟲劑回收率的檢測，同時也比較了4種類型SPE柱，分別為Silica硅膠柱、Pesticarb石墨化碳柱、C18柱，以及Envi-Chrom P聚苯乙烯二乙烯基苯柱對這5種新煙堿類殺蟲劑的保留能力，結果見表1。從表1可以看出，石墨化碳柱和聚合物柱對這5種殺蟲劑的保留能力均強于C18柱，硅膠柱的保留能力最弱。這與Kaufmann的結論一致［15］，Kaufmann認為，農殘分析時，石墨化碳或者聚合物柱的純化效果比C18和C8柱要好，聚合物柱不適合于“烯啶蟲胺”的分析。因此，選擇20%甲醇水溶液作萃取劑，CleanertPesticarb石墨化碳柱作SPE柱。而后，比較了不同體積甲醇對這5種新煙堿類殺蟲劑的洗脫效率，結果見表2。由表2看出，30 mL甲醇既可以將這5種殺蟲劑全部洗脫，而且洗脫液濃縮后顏色為無色至淡黃，避免了煙草色素對液相色譜柱的污染。

表1 不同甲醇濃度萃取劑、SPE柱類的5種新煙堿類殺蟲劑的回收率①（%）

表2 不同體積甲醇洗脫劑的5種新煙堿類殺蟲劑回收率（%）

2.2 LC-MS/MS條件的確定

石隆平等［10］在分析“烯啶蟲胺”原藥純度時，選擇流動相甲醇和水梯度洗脫：100%水20 min內至50%甲醇和50%水，將“烯啶蟲胺”與雜質分離。吳培等［16］發現，采用40%甲醇和60%水可使烯啶蟲胺分離。而曹愛華等［9］發現，采用甲醇/水（60/40）作流動相，可使“吡蟲啉”良好分離。本實驗最初選擇由少量甲醇（5%）組成流動相，縮短了“烯啶蟲胺”的出峰時間，梯度洗脫至40%甲醇，可使“烯啶蟲胺”的完全分離。梯度洗脫至60%甲醇，“吡蟲啉”，“啶蟲咪”，“噻蟲啉”和“噻蟲嗪”得到完全分離（圖2），而醋酸銨的加入，有利于樣品的正離子化效率［17］。

圖2 混合標準樣品的MRM圖

質譜采用多反應檢測模式（MRM），實驗確定［M+1］+為母離子，以手動進樣選擇監測離子對，確定2對離子對作為每種殺蟲劑監測離子對，1對為定量離子對，1對為輔助定性離子對，分別對各離子對離子化以及質譜參數進行了優化，結果見表3。

表3 5種新煙堿類殺蟲劑的MRM參數①

2.3 工作曲線與檢測限

準確稱量“烯啶蟲胺”、“噻蟲嗪”、“吡蟲啉”、“啶蟲咪”和“噻蟲啉”各10 mg，分別置于5個100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得濃度100 μg/mL標準儲備溶液。移取“烯啶蟲胺”、“噻蟲嗪”、“吡蟲啉”、“啶蟲咪”和“噻蟲啉”的標準儲備溶液各10 mL，傾于同一只100 mL容量瓶中，用甲醇定容，得濃度為10 μg/mL的混合標準溶液，同樣方法得到濃度為5.0，2.0，1.0，0.5和0.1 μg/mL混合標準溶液。將6個濃度的混合標準溶液按濃度由低到高的順序進樣進行LC-MS/MS分析，并以峰面積（y）對其相應濃度（x，μg/mL）進行線性回歸分析，得到各組分的工作曲線回歸方程及相關系數（表4）。取最低濃度的標準溶液，連續進樣10次，并計算這些數據的標準偏差（SD），以3倍SD和10倍SD分別作為儀器的檢測限和定量限，結果見表4。可以看出，在設定0.1～10 μg/mL濃度范圍內，5種殺蟲劑線性關系良好，適合于定量分析。

2.4 回收率與重復性

取2份（5 g/份）無農藥殘留的空白煙葉樣品中分別添加0.10和1.00 mg/kg的混合標準溶液，然后用本方法測定各組分含量，并根據測定量和加標量計算回收率，結果見表5。由表5可以看出，在0.10和1.00 mg/kg添加水平下，5種殺蟲劑的回收率在80%～92%之間。3次平行測定，5種殺蟲劑的相對標準偏差（RSD）分別為2.58%，2.50%，3.83%，2.59%，4.08%，說明本方法準確度和重復性均達到了農殘分析的要求。

表4 標準曲線及檢測限

表5 5種殺蟲劑的回收率（%）

3 結論

建立了一種甲醇水溶液萃取，Pesticarb石墨化碳柱凈化，LC-MS/MS同時檢測煙葉5種新煙堿類殺蟲劑的方法。本方法操作簡便，準確性和重復性均較好，適合于煙葉中新煙堿類殺蟲劑的殘留分析。

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