二維液相色譜法測定卷煙主流煙氣中的間-苯二酚及其他酚類化合物

顏權平，王丁麗，趙閣，郭吉兆，謝復煒

中國煙草總公司鄭州煙草研究院煙草行業煙草化學重點實驗室，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號450001

近10年來，高效液相色譜（HPLC）法在卷煙主流煙氣中酚類化合物主要是鄰-苯二酚、間-苯二酚、對-苯二酚、苯酚、鄰-甲酚、間-甲酚和對-甲酚的分析中得到了廣泛的應用［1-3］，YC/T 255—2008［4］也規定采用此法測定。然而，由于卷煙主流煙氣中間－苯二酚的含量較低，同時又有其他物質干擾，不能對卷煙主流煙氣中間－苯二酚進行準確定量。二維液相色譜［5］是將分離機理不同而又相互獨立的兩支色譜柱串聯起來構成的分離系統，完全正交的二維液相色譜的峰容量是兩種一維分離模式單獨運行時峰容量的乘積［6-7］。Dugo等［8］利用二維液相色譜系統分析了紅酒中的多酚類物質，與一維液相色譜相比，分析時間減少，分離能力大大增加；Cacciola等［9］利用二維液相色譜系統分析了啤酒和紅酒中的酚酸類和黃酮類的抗氧化劑物質，共分離了24種酚酸類和黃酮類物質，擴大了分析對象，提高了方法的分析能力。而有關二維液相色譜法測定卷煙主流煙氣中的酚類化合物鮮見報道，因此進行本研究，旨在為卷煙主流煙氣中這7種酚類化合物的準確定量提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

醋酸（色譜純），苯酚，對、鄰、間－苯二酚，對、間、鄰-甲酚（純度＞99.5%）（Chem servie）；乙腈（色譜純，Dikma化學試劑公司）；超純水（電阻率≥18.2MΩ·cm）。

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配備自動進樣器、柱溫箱（配備六通閥）、熒光檢測器；SM450直線型吸煙機（英國Cerulean公司）；CP224S電子天平（感量：0.000l g，德國Sartorius公司）；KQ-700DE型超聲波振蕩器（昆山舒美公司）；Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）。

1.2 樣品處理與分析

將卷煙樣品在（22±1）℃和相對濕度（60±2）%條件下平衡48 h，用SM450吸煙機按照YC/T 29—1996規定的條件抽吸卷煙，每個孔道抽吸4支煙，用劍橋濾片捕集卷煙主流煙氣。吸畢，取出濾片。將l張捕集煙氣粒相物的劍橋濾片折疊，放入100 mL錐形瓶中，加入50 mL l%（體積分數）醋酸水溶液，室溫下超聲萃取20 min，靜置5 min。取2 mL萃取液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液取樣進行LC×LC分析。分析流程如圖1。當柱切換閥處于位置1時，樣品在色譜柱1上進行前期分離。樣品收集環連同色譜柱2用10%乙腈水溶液進行平衡沖洗；當閥切換至位置2時，把一維分離中的某一時間段的分離組分切換至200 μL的樣品收集環進行收集；當閥再次處于位置1時，色譜分析系統泵2的流動相將收集在樣品收集環中的組分反沖至色譜柱2，進行下一步的色譜分離。

圖1 二維液相色譜分析流程

一維色譜條件為：色譜柱：AgilentXDB-C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）柱；流動相：1%冰醋酸水溶液（A）、乙腈（B）；梯度洗脫：0 min，10%B；1 min，35%B；4 min，35%B；8 min，80%B；12 min，80%B；15 min，10%B；20 min，10%B；柱溫：30℃；柱流速：0.5 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：Ex=275 nm，Em=315 nm；中心切割時間：2.9～3.3 min；二維色譜條件為：色譜柱：Zorbax CN（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱；流動相：10∶90乙腈水溶液；等度洗脫：流速1 mL/min；檢測波長：同一維色譜。

采用與標樣比較保留時間法定性，外標工作曲線法定量。

2 結果與討論

2.1 中心切割時間的確定

在YC/T 255—2008規定的條件下，卷煙主流煙氣中的間－苯二酚不能與干擾物完全分離，而二維液相色譜系統將一維色譜分離時間－苯二酚與干擾物質一起切換至第二維色譜柱，通過第二維色譜柱將其分離以進行準確定量，并對卷煙樣品主流煙氣中的其他酚類化合物進行了分析測定。結果（圖2）顯示，在第一維色譜柱分離時，對于標準樣品，除對、間－甲酚不能基線分離外，其他幾種酚類物質都能夠達到基線分離，但對于卷煙樣品，對、間－甲酚，間－苯二酚都不能達到很好的基線分離。標準樣品間－苯二酚的保留時間為3.14 min，卷煙樣品中間－苯二酚與其干擾物的出峰時間從2.75～3.75 min，根據標準樣品的保留時間和卷煙樣品中干擾物的保留時間，確定中心切割的時間為2.9～3.3 min。

圖2 標準樣品和煙氣樣品的一維HPLC圖

2.2 第二維色譜柱的選擇

對于二維液相色譜系統來說，第二維色譜柱是影響二維色譜系統分離能力的關鍵因素，主要考察了3種不同柱填料的色譜柱：C8柱（Zorbax SB-C84.6 mm×150 mm，5 μm）、苯基柱（Zorbax SB-Phenyl 2.1 mm×150 mm，5 μm）和氰基柱（Zorbax CN 4.6 mm×250 mm，5 μm）對間－苯二酚與其干擾物的分離效果，結果見圖3。從圖3可以發現，當第二維色譜柱采用C8和苯基柱時，卷煙主流煙氣中的間－苯二酚與其它干擾物都不能達到基線分離，而當第二維色譜柱采用氰基柱時，樣品中的間－苯二酚和干擾物能夠達到基線分離，考慮到目標分析物的分離效果，選用氰基柱作第二維色譜柱。

2.3 第二維色譜流動相的確定

圖3 間－苯二酚在不同的二維色譜柱上的HPLC圖

考慮到方法的簡便性，第二維色譜柱主要采用水和乙腈等度洗脫，在流速1 mL/min，Ex=275 nm和Em=315 nm條件下，以卷煙樣品主流煙氣中的酚類化合物為對象，考察了4種不同比例流動相［乙腈∶水（體積比）＝5∶95，10∶90，15∶85，20∶80］的色譜分離情況。結果（圖4）表明，當用10∶90乙腈水溶液作流動相時，卷煙樣品主流煙氣中間－苯二酚能夠與干擾物質達到很好的基線分離，因此，選擇10∶90乙腈水溶液作第二維色譜柱的流動相。

2.4 中心切割的穩定性

為了考察二維液相色譜系統的穩定性，通過六通閥在2.9～3.4 min時間段對標準樣品和實際卷煙煙氣樣品進行了連續10次中心切割和二維HPLC分離試驗。結果表明，對于同一個標準樣品，其間－苯二酚峰面積的RSD為1.16%，保留時間的RSD為0.16%；對于同一個卷煙煙氣樣品，其間－苯二酚峰面積的RSD為1.06%，保留時間的RSD為0.11%。這說明，本二維液相色譜系統能夠對卷煙樣品中間－苯二酚進行穩定的中心切割分離。

圖4 間－苯二酚在第二維色譜柱4種流動相下的HPLC圖

表1 同一標準樣品和煙氣樣品連續10次中心切割和二維HPLC分離的間－苯二酚的保留時間、峰面積及其RSD

2.5 工作曲線與檢測限

準確稱取100 mg鄰-苯二酚、對-苯二酚、苯酚，50 mg鄰-甲酚、間-甲酚，20 mg的間-苯二酚，置于同一只燒杯中，加入30 mL 1%乙酸水溶液，待完全溶解后，轉移到100 mL棕色容量瓶中，用1%乙酸水溶液定容，得到7種酚的標準樣品混合物的儲備溶液。取10.00 mL儲備溶液，用1%乙酸水溶液稀釋至100 mL，得一級標準溶液。再取10 mL一級標準溶液，用1%乙酸水溶液稀釋至100 mL，得到二級標準溶液。移取1，2，5 mL二級標準溶液，1，2 mL一級標準溶液，分別用1%乙酸水溶液稀釋至50 mL，得5個標準溶液。對5個標準溶液和二級標準溶液分別進行二維HPLC分析，并以酚類化合物的積分峰面積對其濃度進行回歸分析，得7種酚類化合物的標準曲線方程（表2）。將最低濃度的標準溶液平行測定10次，將其測定結果標準偏差的3倍作為測定方法的檢測限，10倍作為測定方法的定量限（表2）。7種酚類成分的檢測限均在ng級的水平，遠遠低于卷煙煙氣中酚類成分的釋放量［3］。

2.6 回收率與精密度

在已知釋放量（5次平行測定的平均值）的卷煙煙氣樣品中添加3個濃度水平的酚類標準樣品混合物，然后分別進行二維HPLC測定，并根據已知量、加標量和加標后測定量計算各酚的回收率，結果見表3。由表3可見，卷煙煙氣中酚類化合物的回收率在97.8%～100.2%之間，說明本方法對卷煙煙氣中這些酚類成分的測定較為準確。

采用本方法對同種樣品一天內平行測定5次，得到了日內精密度（表4）；對同一樣品連續測定5 d，得到了日間精密度（表5）。由此可見，7種酚類化合物的日內和日間RSD均小于5.5%，說明本方法的重復性較好。

2.7 部分卷煙樣品煙氣中7種酚的釋放量

采用本方法和行業標準方法［13］分別測定了2R4F，3R4F 2種參考卷煙和10種國產商品卷煙（5種混合型卷煙和5種烤煙型卷煙）主流煙氣中的7種主要酚類化合物的釋放量，結果見表6。由此可見，本方法測定的2R4F卷煙間－苯二酚的釋放量比該行業標準方法的測定值低，也低于Moldoveanu［14］利用HPLC-FLD法測定值0.84 μg/支，可能是該行業標準方法和Moldoveanu方法都不能使間－苯二酚與干擾物質達到基線分離造成的。其他6種酚類化合物釋放量的測定值2種方法比較接近。

表2 方法的標準曲線、檢測限

表4 酚類化合物日內檢測值及其精密度（n=5）（μg/支）

表5 酚類化合物日間檢測值及其精密度（n=5）（μg/支）

表6 本方法和標準法測定的2種參考卷煙和部分商品卷煙樣品主流煙氣中酚類化合物的釋放量（μg/支）

3 結論

建立了中心切割二維液相色譜測定卷煙主流煙氣中的主要酚類化合物的方法；本方法能夠實現間-苯二酚與干擾物質的有效分離，與行業標準方法相比，能夠準確定量卷煙主流煙氣中的間-苯二酚，同時不影響其它酚類物質的準確測定。

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