打頂及仿生信號分子對煙草氧化脅迫的影響

張新華，姚忠達，陳常偉，查向東，程新勝*

1.中國科學技術大學煙草與健康研究中心，合肥市徽州大道1129號230052

2.安徽大學生命科學學院，合肥市肥西路3號230039

3.安徽中煙工業(yè)公司技術中心，合肥市天達路9號230088

植物在受到昆蟲傷害或其他機械性創(chuàng)傷時其組織內可誘發(fā)大量活性氧積聚，使植株形成氧化脅迫［1］，并激活以茉莉酸（Jasmonic acid，JA）為主要信號分子的抗性反應［2］，使碳水化合物的分配路徑、次生代謝產物的形成發(fā)生變化，促使大量抗生性物質積累。打頂是煙草生產上一項提高煙葉產量、質量的重要技術措施［3］，關于打頂對煙葉的影響已有大量研究［4-7］，但打頂對煙草來說也是一種機械性損傷，這種損傷對此生長時期的煙草植株產生氧化脅迫尚未見報道。另外，一些取食煙草的寡食性昆蟲（如煙青蟲Heliothis assulta Guenee）通過下唇腺分泌特異性酶，抑制創(chuàng)傷信號分子的積累和傳遞，從而降低其取食對煙株的刺激，減少煙堿合成與傳遞［8-9］。黃蘭等［10］選取由昆蟲下唇腺特異性酶產生的與創(chuàng)傷信號相頡抗的仿生型信號分子BSM（Bionics Signal Molecule），在煙草打項后將其涂抹在打頂煙株創(chuàng)傷端面，可以降低煙草生物堿的含量。為此，進行了打頂后一定時期內煙草植株的氧化脅迫反應以及BSM對煙草這一氧化脅迫的抑制效應研究。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試品種為白肋煙鄂煙1號（Nicotiana tabacum cv.Eyanyihao），2010年在中國科學技術大學南區(qū)實驗基地種植。采用溫室盆栽，盆高35 cm，直徑25 cm，每盆裝過篩風干土至2/3處，施氮量為64 g/株，按N∶P∶K=1∶1.5∶2.5施用煙草專用復合肥。

1.2 儀器與試劑

756P型紫外-可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）、超聲儀（Autoscience公司）、FA1004電子天平（上海天平儀器廠）、TGL-20G高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）、pHS-3C型精密pH計（上海雷磁儀器廠）；HH-8電熱恒溫水浴鍋（深圳國華儀器廠）、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）、Olympus SP-560UZ數(shù)碼相機。

3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB，上海晶純試劑有限公司）；氮藍四唑（NBT，Sigma公司）；鹽酸羥胺（AR，上?；瘜W試劑廠）；α-萘胺（CP，上海泗聯(lián)化工廠）；對氨基苯磺酸（AR，國營上?；瘜W試劑廠）；聚乙烯毗咯烷酮（PVP，國藥集團化學試劑有限公司）；EDTA-Na2（CP，中國上海試劑一廠）；核黃素（BR，上海化學試劑廠）；水合氯醛（AR）、硫代巴比妥酸（BR）、三氯乙酸、甲硫氨酸（BR）（中國醫(yī)藥上海化學試劑公司）。

1.3 試驗處理

設置對照（CK）、處理1（T1，常規(guī)打頂）與處理2（T2，常規(guī)打頂＋涂抹BSM）3個處理。其中T2處理組中，BSM的濃度是1.0 mol/L，打頂后立即用中號羊毫蘸取約0.25 mL BSM涂抹于處理株傷口端面。每株煙打頂后的總留葉數(shù)為20片，每組處理均取10株煙苗分別掛牌標記。在打頂后3，6，12，24，48 h采摘第18葉（從上至下數(shù)）測定超氧陰離子（O2-·）、過氧化氫（H2O2）含量；打頂后2，4，6，8和10 d采摘第19葉測定超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。

1.4 樣品處理與生化分析

參照王愛國等［11］的方法測定O2-·含量：在采集的煙葉上用打孔器取直徑為6 mm小圓片，稱取1 g，放入50 mL燒杯中，并加入10 mmol/L鹽酸羥胺5 mL，真空滲入10 min后，將燒杯置于30℃溫箱中溫育45 min。溫育結束后，從樣品試管中吸取2mL溶液，與1 mL 17 mmol/L對氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol/L α-萘胺混合，顯色反應10 min。測定530 nm下樣品的吸光度，根據(jù)標準曲線得出吸光度與O2-·含量滿足：CO2-·=（2×A530-0.0286）/0.0215。

參照文獻［12］對H2O2進行活體組織化學原位檢測：取上部葉，用雙蒸水洗3次，在葉片前端葉脈兩側（避免取葉脈）剪下直徑4 cm煙葉圓片，取酸化的1 mg/mL DAB溶液15 mL，混合后反應8 h。然后取出葉圓片，將其固定并在95%乙醇中煮沸10 min，然后取出在95%乙醇中洗滌3次，觀察葉片上枯斑并用數(shù)碼相機拍照。

丙二醛（MDA）含量分析：參照文獻［13］并稍作改進，將采取葉片去葉脈，取鮮重0.5 g，置于預冷研缽中，加入2 mL 0.05 mol/L pH7.8的磷酸緩沖液和少量石英砂研磨、勻漿后，定容到10 mL刻度試管中。取5 mL于刻度試管中在16000 r/min下離心15 min，上清液即為樣品提取液，5℃下保存?zhèn)溆?。? mL試管分別加入1.5 mL粗酶液，2.5 mL，0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液，混勻物于沸水浴上加熱15 min，迅速冷卻后，再離心。取上清液測定532和600 nm波長下的吸光度值。

MDA的濃度公式：C=［（A532-A600）×A×V/a］/0.155×W

式中：A——反應液總量；V——提取液總量；a——反應液中的提取液數(shù)量；W——植物樣品重量。

SOD活性測定［14］：取煙草葉片（去葉脈）0.5 g于預冷的研缽中，使溶液終體積為10 mL。取4 mL于18000 r/min下離心20 min，上清液即為SOD粗提液。分別加入1.5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液，0.3 mL 130 mmol/L Met溶液，0.3 mL 750 μmol/L NBT溶液，0.3 mL 100 μmol/L EDTA-Na2液，0.3 mL 20 μmol/L核黃素0.1 mL酶液，0.5 mL蒸餾水?；靹蚝髮?支對照管置暗處，其他各管于30℃4000 Lx日光下反應30 min。分別測定其在560 nm處的吸光度值。已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示，計算SOD活性。

SOD總活性＝（Ack－AE）×V/（Ack×0.5×W×Vt）

式中：Ack——照光對照管的吸光度；AE——樣品管的吸光度；V——樣品液總體積（mL）；Vt——測定時樣品用量（mL）；W——樣鮮重（g）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel，Matlab7.0軟件進行Stdev分析。

2 結果與分析

2.1 打頂與BSM對白肋煙中超氧陰離子含量的影響

圖1結果表明，對照煙葉中活性氧含量在48 h內變化基本平穩(wěn)。打頂T1處理能誘導植物葉片產生大量活性氧，以打頂后3 h的O2-·含量最高，明顯高于CK與T2處理，之后漸趨下降，在24 h后其含量快速下降，到48 h O2-·含量接近其他兩個處理。T2處理葉片中O2-·的含量一直介于CK與T1處理之間，但在檢測時間內其變化趨勢與CK及T1不同：在3 h后仍呈上升趨勢，12 h后呈明顯下降趨勢，至48 h O2-·含量與其他兩處理接近。

2.2 打頂及BSM對白肋煙H2O2含量的影響

圖1 打頂及BSM對白肋煙O2-·含量的影響Fig.1 The effects on burley tobacco O2-·content by topping and BSM

二氨基聯(lián)苯胺（DAB，3，3′-diaminobenzidine）在H2O2的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化和積累，形成棕褐色沉淀［15］，葉片上褐色面積與組織中H2O2含量呈正相關。圖2結果表明，在5個不同時間段的樣品中，總體上均呈現(xiàn)出T1處理的褐斑面積大或顏色最深，表明其組織中的H2O2明顯高于CK與T2處理，并以打頂后6 h的褐色沉淀斑點最顯著；而CK 5個時間段的樣品上，葉片中褐色沉淀斑點變化不明顯且斑點面積最少；而打頂后涂抹BSM的T2處理，在5個時間段中，除48 h外，其他時間段內其葉片上褐色斑面積與CK差異不明顯，且5個時間段樣品上的色斑明顯小于T1處理。表明打頂后煙草的葉片組織內迅速積累了H2O2，而涂抹BSM降低了H2O2的積聚。

2.3 打頂與BSM對白肋煙MDA含量的影響

MDA是細胞膜脂過氧化的最終分解產物，其含量代表著氧化脅迫對葉片細胞膜脂質雙分子層過氧化的程度［14］。從圖3可見，不打頂?shù)腃K，從第2天至第10天葉片中MDA含量稍有增加但變化平緩；T1處理中的MDA高于CK與T2處理，且在2～10 d內葉片中MDA含量變化不明顯；T2處理中，在第2天的MDA含量最高，大大高于CK但仍低于T1處理，且隨著時間的推移呈明顯下降趨勢，至第10天時，MDA含量達到最低?？傮w來看，打頂使煙株組織細胞膜發(fā)生了過氧化反應形成了MDA的積累，但BSM處理能顯著降低葉片中MDA的含量。

圖2 不同處理對白肋煙H2O2含量的影響Fig.2 The effects on burley tobacco H2O2content by different treatment

圖3 不同處理中白肋煙中MDA的變化Fig.3 The effects on burley tobacco MDA content by different treatment

2.4 打頂與BSM對白肋煙SOD活性的影響

由圖4可見，在不打頂條件下，測定不同時間段內白肋煙葉片中SOD活性變化不明顯；而T1處理中，打頂引起了煙葉中SOD活性的明顯變化，在打頂后第4天，與CK和T2處理相比，T1處理的SOD活性明顯降低，隨著時間的推移，T1處理葉片中SOD活性逐漸上升，到第10天，與CK和T2處理基本一致；但打頂后涂抹BSM較大幅度地提高了煙葉中SOD活性，T2處理與CK的煙葉SOD活性基本相近。

圖4 不同處理白肋煙SOD活性的變化Fig.4 The effects on burley tobaccoSOD activity different treatment

3 小結與討論

本研究結果表明，煙株打頂會導致煙草葉片在打頂后一段時間內產生并積累超氧自由基（O2-·），H2O2，其組織中SOD酶活性降低，同時MDA含量增加，說明煙草打頂這一機械損傷能使煙草植株形成氧化脅迫并且導致葉片細胞膜脂質雙分子層發(fā)生過氧化反應；源于昆蟲下唇腺特異性酶的BSM可以大幅度提高SOD活性，降低O2-·，·OH和H2O2含量，并且BSM還減少了MDA的含量，說明BSM可緩解打頂對煙草葉片的氧化脅迫。

內源茉莉酸可激活煙堿合成關鍵性酶－腐胺N－甲基轉移酶（Putrescine N-methyltransferase PMT）基因的轉錄，誘導煙草生物堿的合成［16］。而JA這一信號分子是由亞麻酸起始的十八烷酸途徑在植物體內合成的［17］，即植物在發(fā)生過氧化脅迫、細胞膜發(fā)生過氧化后α－亞麻酸被釋放，在質體中經(jīng)脂氧合酶（LOX）、丙二烯氧合酶（AOS）和環(huán)化酶（AOC）的催化生成12－氧－植物二烯酸（12-O-PDA）進入細胞質中，在過氧化物體中經(jīng)3次β－氧化形成JA［18］。在打頂后涂抹BSM使煙草葉片中生物堿含量下降，正是由于BSM在信號傳導的上游通過抑制煙草植株的氧化脅迫，減少了煙草植物體內JA的合成，從而導致煙葉煙堿含量的降低。

［1］Guan L M，Scandalios J G.Hydrogen peroxide-mediated catalasegeneexpressioninresponsetowounding［J］.Free Radical Bio Med，2000，28（8）：1182-1190.

［2］FarmerEE，JohnsonRR，RyanCA.Regulation of expression of proteinase inhibitor gene by methyl jasmonate and jasmonic acid［J］.Plant Physiol，1992，98（3）：995-1002.

［3］Davis D L，Nielson M T.Tobacco production，chemistry and technology［M］.Oxford：Blackwell Science，1999：120-126.

［4］蘇德成.中國煙草栽培學［M］.上?？茖W技術出版社，2005：373-375.

［5］程君奇，周群，楊春雷，等.打頂時期對白肋煙煙葉腺毛分泌物的影響［J］.煙草科技，2009（9）：50-54.

［6］鄒焱，蘇以榮.打頂及施用植物生長調節(jié)劑對煙草內源激素的影響［J］.煙草科技，2008（10）：50-52，57.

［7］李章海，劉登乾，田必文，等.打頂和施用NAA對煙株生長、煙堿合成和鉀素吸收的影響［J］.煙草科技，2008（9）：52-55.

［8］華煜，林國平，黃文昌，等.仿生型信號分子對煙草硝酸鹽、亞硝酸鹽的抑制作用［J］.煙草科技，2010（4）：51-53，58.

［9］MusserRO，Hum-MusserSM，EichenseerH，etal.Herbivory：caterpillar saliva beats plant defences［J］.Nature，2002，416（6881）：599-600.

［10］黃蘭，王正剛，舒俊生，等.仿生型信號分子對煙草主要生物堿的調控作用［J］.中國煙草學報，2010，16（5）：1-5.

［11］WangAG，LuoGH.Quantiativerelationbetweenthe reaction of hydroxylamine and superoxide anion radicals in plants［J］.Plant Physiol Commun，1990（6）：177-179.

［12］Wang C F，Huang L L，Buchenauer H，et al.Histochemical studies on the accumulation of reactive oxygen species（O2-·and H2O2）in the incompatible and compatible interaction of wheat-Puccinia striiformis f.sp.tritici［J］.Physiol Mol Plant Pathol，2007，71（4-6）：230-239.

［13］張憲政，陳鳳玉，王榮富.植物生理學實驗技術［M］.遼寧科學技術出版社，1994：164-165.

［14］鄒琦.植物生理學實驗指導［M］.北京：中國農業(yè)出版社，1994：163-164.

［15］Zhang X L，Wang P C，Song C P.Methods of detecting hydrogenperoxideinplantcells［J］.ChineseBulletinof Botany.2009，44（1）：103-106.

［16］Shoji T，Yamada Y，Hashimoto T.Jasmonate induction of putrescine N-methyltransferase genes in the root of nicotinana sylvestris［J］.Plant Cell Physiol，2000，41（7）：831-839.

［17］Sun D Y，Guo Y L，Ma L.Cellur Signal Transduction.Third edition［M］.Beijing：Science press，2001：284-285.

［18］Vick B A，Zimmerman D C.The biosynthesis of jasmonic acid：Aphysiologicalroleforplantlipoxygenase［J］.Biochem Biophys Res Commun，1983，111：470-477.