煙梗廢料固態發酵生產蘇云金芽孢桿菌的適宜條件篩選

杜雷，趙高嶺，席宇，臧曉靜，朱大恒

鄭州大學生物工程系，鄭州高新技術產業開發區科學大道100號450001

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前世界上應用最為廣泛的殺蟲微生物，其發酵方法主要有液體深層發酵和固體淺盤發酵［1］。目前大多數廠家使用的是液體深層發酵，但液體發酵需要昂貴的設備，濃縮和干燥耗能大，成本高，從而影響了生物農藥的推廣和應用。固體發酵作為蘇云金芽孢桿菌工業發酵的方法之一，與液體發酵相比在生產中逐漸體現出其優勢，如廢水、廢渣少，環境污染少，能源消耗量低，工藝設備和技術較簡單，投資低，并且產物濃度高，產品易保存，便于包裝和運輸［2］。煙梗是煙草工業的副產物，我國每年約有數10萬t煙梗廢棄物被棄置浪費［3］。目前主要集中于打葉復烤廠內，不僅占用大量的倉庫還需專人管理，如何對其充分利用已成為企業的迫切需求。目前對煙梗的利用方法主要是制造梗絲和煙草薄片用于卷煙配方中，也有從煙梗中提取煙堿、茄尼醇、煙酸、果膠、植物蛋白等成分［4］的探索研究，但這些方法的利用量不大，每年仍有大量煙梗被廢棄，造成自然資源的浪費。煙梗中含有豐富的有機碳、氮和無機鹽，是很好的發酵培養基質［5］。目前用于蘇云金芽孢桿菌固態發酵的原料主要是農副產品，大量生產相對成本比較高。張怡等［6］將經處理后的廢煙葉作為原料與麩皮混合作為載體，探索了固態發酵法培養蘇云金芽孢桿菌的方法，但直接用煙梗為原料固態培養蘇云金芽孢桿菌的研究尚未見報道。為此，以煙梗為主要發酵原料，對培養基營養成分配比和發酵條件進行了優化，旨在探討利用煙梗采用固態發酵法生產蘇云金芽孢桿菌的可行性，以降低蘇云金芽孢桿菌的生產成本，并為煙梗廢料的綜合利用開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種：蘇云金芽孢桿菌HD-1，商業菌種，本實驗室保存。煙梗由天昌國際煙草有限公司提供。

1.2 培養基

斜面培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉20 g，瓊脂20 g，水1000 mL；液體種子培養基：不加瓊脂即可，在121℃滅菌20 min后備用。

篩選固體培養基：煙梗（粉碎過16目篩），玉米粉，豆餅粉（購于市場），蛋白胨（鄭州創生），酵母粉（英國Oxoid公司），KH2PO4，MgSO4·7H2O，FeSO4，MnSO4（天津市科密歐化學試劑開發中心）。

1.3 培養基成分的優化設計

碳、氮源配比的優化：以煙梗為主要碳源，以蛋白胨、酵母粉、豆餅粉和玉米粉為補充氮源［7］，每個因素選高低4個水平進行正交試驗設計［8］，應用L16（45）正交表對各組分進行優化試驗，考察不同培養基組分對活芽孢數的影響。各因素水平見表1。

無機鹽優化：確定好碳、氮源配比后，將KH2PO4，FeSO4，（NH4）2SO4和MgSO4·7H2O 4個因素作為培養基無機鹽成分，每個因素選3個水平設計正交試驗，應用L9（34）正交表對無機鹽組分進行優化試驗。各因素水平見表2。

表1 培養基的碳、氮源正交試驗水平Tab.1 Level of carbon and nitrogen resourcein medium（g）

表2 培養基的無機鹽正交試驗水平Tab.2 Level of inorganic saltin medium （g）

1.4 三角瓶發酵培養

按照正交試驗設計，將各種配比的培養基配置好后裝入250 mL的三角瓶，加水后搖勻，滅菌接種后培養。培養過程中培養條件先按初始含水率60%，接種量5%，初始pH7.0，放入30℃培養箱培養，定時翻動搖勻培養基，并取樣涂片、染色觀察，至芽孢脫落率達到30%時終止培養，測其活芽孢數。

1.5 培養基條件的優化設計

確定最優培養基營養成分組合后，用單因素試驗方法，分別對接種量，培養基的初始pH，初始含水率進行優化。

1.6 分析方法

采用孔雀綠及沙黃染色法觀察芽孢的形成，平板菌計數法［9］對固體培養芽孢計數。

2 結果與討論

2.1 碳、氮源的優化結果

根據表l正交試驗設計對HD-1菌株進行固體發酵，結果表明（表3）：由極差R可以看出，各因素對產孢量的影響為：煙草廢料＞酵母粉＞玉米粉＞豆餅粉＞蛋白胨；煙梗固態發酵培養基的最佳組合為：煙梗15 g，酵母粉0.2 g，蛋白胨0.2 g，黃豆餅粉1 g，玉米粉0.5 g。煙梗為菌體生長提供碳源，又是菌體生長的載體，且其含有豐富的糖類，很適宜作為發酵材料。由表3可以看出，以蛋白胨為氮源對產芽孢數量影響不大，但以酵母粉、豆餅粉、玉米粉為補充氮源時影響較大，它們與煙梗混合，大大改善了培養基的發酵性能，提高了芽孢產率。

表3 L16（45）碳氮源優化正交試驗設計與結果Tab.3 Designandresulto for thogonal test for optimizingcarbonandnitrogenresource

2.2 無機鹽優化試驗

在菌體的生長中，許多礦質元素都直接參與細胞的組成、能量的轉移、維持原生質的膠質體系和滲透性，對生長起著重要的作用。其中Mg2+，Mn2+，Fe2+，Zn2+，Ca2+的適當濃度對營養細胞的生長、芽孢和伴孢晶體的形成有明顯刺激作用［8］。由表4可以看出，KH2PO4的影響最顯著，其次是MgSO4·7H2O，MnSO4和FeSO4的影響較小。最佳無機鹽配比為KH2PO40.03 g，FeSO40.02 g，MnSO40.03 g和MgSO4·7H2O 0.04 g。

2.3 接種量對芽孢形成的影響

接種量是與培養基利用率直接相關的參數。接種量大時盡管可以使芽孢生長快、周期短，但后期可能因缺乏營養而無法達到較高的芽孢數；而接種量太小時不僅對營養利用不充分，且發酵周期可能延長，染菌幾率提高［10］。在確定最佳培養基組成成分后，將其接種量設為4%，5%，6%，7%和8%5個因素水平進行試驗，結果見圖1。由圖1可知，接種量在6%時產孢量最高，可達9.0×1010CFU/g。

表4 無機鹽優化正交試驗設計與結果Tab.4 Design and result of orthogonal test for optimizing inorganic salt

圖1 接種量對芽孢數的影響Fig.1 Effect of the inoculum size on spores formation

2.4 初始含水率對芽孢形成的影響

初始含水率對芽孢形成有較大的影響。水分適宜則菌體生長好，產品毒力效價高；水分過多則物料通氣性差，菌體得不到充足的氧氣，生長受到限制；水分偏少時，菌體吸收不到水分和溶解在水中的營養，生長也受到限制［11-12］。本試驗將初始含水率設為55%，60%，65%，70%和75%5個因素水平進行試驗，結果見圖2。由圖2可知，當初始含水率為65%時，芽孢數量最高，可達到8.5×1010CFU/g。

2.5 初始pH對芽孢形成的影響

培養基的pH值不僅影響芽孢的萌發，還影響芽孢的形成。本試驗將初始pH設為5.5，6.5，7.5，8.5和9.5 5個因素水平進行試驗，結果見圖3。由圖3可知，初始pH為7.5時，芽孢數最多，可達到9.5×1010CFU/g。當pH為5.5和9.5時，芽孢數明顯減少，這是因為蘇云金芽孢桿菌在芽孢形成的初始階段，菌體合成一種胞外蛋白酶參與伴孢晶體的蛋白質轉化合成過程，而這種酶的合成與酶活性最適pH值為中性，pH值在6.5以下或9.1以上時酶活性急劇下降，喪失形成這種酶的變異菌株既不能形成芽孢，也不能形成晶體［13］。

圖2 初始含水率對芽孢數量的影響Fig.2 Effect of initial moisture content on spore formation

圖3 初始pH對芽孢數量的影響Fig.3 Effect of initial pH on spore formation

3 小結

通過正交試驗設計，確定了固態發酵培養蘇云金芽孢桿菌的最佳培養基組成，其中包括煙梗廢料88.13%，酵母粉1.17%，蛋白胨1.17%，豆餅粉5.88%，玉米粉2.93%，KH2PO40.18%，MgSO4·7H2O 0.24%，FeSO40.12%，MnSO40.18%。補充培養基營養成分和無機鹽對蘇云金芽孢桿菌的生長和芽孢產量有較大促進作用。

通過單因素試驗確定了最佳培養條件為：接種量為6%，初始含水率65%，初始pH7.5，在此發酵條件下蘇云金芽孢桿菌HD-1的芽孢數可穩定在9.5×1010CFU/g，達到了每克培養物含芽孢數100億個以上的國家標準［14］。

本試驗證實了以煙梗作為培養基進行固態發酵生產生物農藥的可行性，與液體發酵法相比［15］，其產孢量大大提高，且在生產中更易于推廣應用。

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