6個新的STR基因座復合擴增體系的建立及應用

劉俊宏，邵偉波，李 莉，楊 穎

（1.華東政法大學，上海200042；2.蘇州大學 醫學部法醫學系，江蘇 蘇州215123；3.司法部司法鑒定科學技術研究所，上海市法醫學重點實驗室，上海200063；4.上海市血液中心，上海200051）

短串聯重復序列（short tandem repeat，STR）通常是由長度為2～5個堿基的核心序列串聯重復而成，具有分布廣泛、多態性高及易于擴增等特性[1]，STR分型已成為法醫物證檢驗的主要技術手段。目前我國廣泛使用的試劑盒主要為Identifiler○R，SinofilerTM和Powerplex○R16 System，基本上可以滿足個體識別和親子鑒定的需要，但在突變和特殊案件中，需要檢測更多的STR基因座來補充當前STR系統的不足。本研究選擇了非CODIS系統的6個基因座，即D4S2366、

D3S3045、D18S1002、D20S481、D22S689、D4S2639，建立了熒光復合擴增檢測體系，并將該體系應用于224名華東漢族無關個體的基因型檢測，評估了其作為新的遺傳標記在華東漢族人群中的法醫學價值。

1 材料和方法

1.1 樣本

224份血斑（每份約3mm×3mm大小），分別來源于華東地區漢族無關個體，Chelex-100法[2]提取血液DNA。

1.2 引物

6個基因座的熒光引物序列來自GDB基因組數據庫，其具體信息和熒光素標記見表1。所有引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.3 PCR復合擴增體系及產物檢測

PCR復合擴增體系為20μL，內含10×PCR buffer 2 μL，2 mmol/L dNTPs 2 μL，25 mmol/L Mg2+2 μL，primer pair mix 2μL，AmpliTaq GoldR○DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板量5μL，純水6.5μL。采用9700型擴增儀（美國AB公司）進行擴增，循環參數為：95℃15min；94℃30s，56℃90s，72℃60s，循環30次；60℃60min；4℃保存。

取PCR擴增產物1μL、去離子甲酰胺（美國AB公司）10μL、內標SIZ-350（無錫中德美聯生物技術有限公司）0.3μL混合，95℃變性3min，冰浴3min，使用3130遺傳分析儀（美國AB公司）電泳檢測。

1.4 等位基因測序、命名

根據在GALAXY網站上查到的DNA序列，采用Primer premier5.0軟件設計用于克隆測序的PCR引物，其具體信息見表2。設計好的引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。選取每個基因座各個等位基因的樣本，用所合成的測序引物分別對其進行PCR擴增，產物送上海生工生物工程技術有限公司進行測序，根據各等位基因的測序結果，確定核心序列重復次數，按照國際法醫血液遺傳學會DNA委員會ISFH推薦的命名原則進行命名[3~4]。

表1 復合擴增體系中6個基因座的引物特征

表2 6個基因座的測序引物特征

1.5 等位基因梯度標準（Allelic Ladder）的制備

選取各基因座含不同等位基因的樣本，用熒光標記引物單獨擴增后，通過多次調節模板量濃度、擴增次數及混合比例，制備Allelic Ladder。

1.6 靈敏度檢測

將標準品DNA 9947A（10ng/μL）稀釋成如下濃度梯度：2 ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL、0.125ng/μL、0.0625 ng/μL、0.03125 ng/μL、0.015625 ng/μL，用復合擴增體系進行擴增，擴增產物在3130遺傳分析儀上電泳檢測。

1.7 統計學分析

運用PowerStats V12.xls[5]軟件統計分析D4S2366等6個非CODIS STR基因座的等位基因頻率、雜合度（H）、個體識別能力（DP）和多態信息含量（PIC）等參數，采用Cervus2.0軟件統計分析二聯體非父排除率（PED）和三聯體非父排除率（PET），并進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，檢驗水準α=0.05。

1.8 排除效能統計

運用所建立的復合擴增體系，對93個經Sinofiler試劑盒（美國AB公司）檢測已排除非父的二聯體案例進行分析，討論其在實際案例中的運用價值。

2 結果

2.1 6個STR基因座的熒光標記復合擴增體系

本文構建的6個非CODIS STR基因座熒光標記復合擴增體系分型穩定，具有種屬特異性，且適用于各類生物學檢材。標準品DNA 9947A的分型結果見圖1。

2.2 6個STR基因座各等位基因測序結果

通過測序得到6個STR基因座每個等位基因的核心重復序列（見表3），按國際法醫遺傳學會推薦原則，以核心序列重復次數命名等位基因。

2.3 Ladder制備結果

將6個STR基因座的各個等位基因用熒光標記引物進行擴增，依照熒光強度調節各個PCR產物的比例，制成Ladder見圖2。

2.4 靈敏度檢測結果

將標準品DNA 9947A（10ng/μL）稀釋成如下濃度梯度：2ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL、0.125ng/μL、0.0625ng/μL、0.03125ng/μL、0.015625ng/μL，用復合擴增體系進行擴增，擴增產物在3130遺傳分析儀上電泳分離，使用Genemapper軟件分析結果。在四種熒光素中，ROX產生的峰高普遍低于其它熒光素，通過觀察用ROX標記的基因座的峰高，發現20 μL體系中模板DNA濃度為0.125ng/μL時效果最好，但濃度低至0.03125ng/μL時仍能得到正確的分型結果，提示該體系的靈敏度為156.25pg。

表3 6個STR基因座各等位基因的序列特征

2.5 6個基因座的等位基因頻率分布

圖1 標準品DNA9947A分型圖

在華東地區漢族 224名無關個體中，6個非CODIS STR基因座共檢出52個等位基因，各等位基因頻率見表4。

圖2 6個STR基因座的Allelic Ladder

2.6 法醫學參數

經過統計分析，D4S2366等6個STR基因座的雜合度（H）分布為 0.714～0.808，個體識別率（DP）為0.874～0.934，二聯體非父排除率（PED）為0.310～0.453，三聯體非父排除率（PET）為0.485～0.628，多態信息含量（PIC）為0.672～0.784，基因型頻率分布通過Hardy-Weinberg平衡檢驗（P＞0.05），見表5。6個STR基因座的二聯體累積非父排除率（CPED）為0.947689，三聯體累積非父排除率（CPET）為0.993345，累積個人識別能力（CDP）為0.999999543。

2.7 實際案例應用

將復合擴增體系應用于93例二聯體排除案例，每個基因座的排除概率（見表6）與其二聯體非父排除率（PED）指標（見表5）基本一致。

表4 6個STR基因座在華東漢族人群的等位基因頻率分布 （n=224）

表5 華東漢族人群6個STR基因座的相關法醫學參數（n=224）

3 討論

構建熒光標記復合擴增體系的主要步驟包括基因座的選擇、引物設計、擴增體系和擴增條件的優化。引物的設計選擇要有高度特異性，不同引物之間不能互相干擾，應避免引物二聚體、發夾結構等，同時還需要考慮片段大小等因素。本研究采用的是多重PCR擴增體系，作者通過大量實驗調整各個基因座的引物量，最終得到了比較理想的配比方案。同時，對退火溫度及循環次數也進行了梯度試驗，建立了合適的PCR擴增方法。復合PCR體系中，模板濃度的最低量為0.03125ng/μL，各個STR基因座的擴增片段大小均小于350bp，因此適用于降解檢材的DNA分型。

本文選擇的是6個非CODIS STR基因座，通過對華東漢族224個無關個體的檢測，在D4S2366、D3S3045、D18S1002、D20S481、D22S689、D4S2639STR基因座分別檢出 7、8、9、10、9、9個等位基因和 21、26、21、23、28、32種基因型，各基因座的基因型均符合Hardy-Weinberg平衡。6個基因座中，D4S2639非父排除率最高，D20S481非父排除率最低，各基因座平均雜合度（H）為 0.760，平均個體識別率（DP）為0.910，平均多態信息含量（PIC）為0.735，二聯體累積非父排除率（CPED）為0.947689，三聯體累積非父排除率（CPET）為 0.993345，累積個人識別能力（CDP）為0.999999543，表明上述6個STR基因座在中國漢族人群中具有高度的多態性，其復合擴增體系的效能適用于法醫學個人識別。另外，作為常規STR標記的補充，上述6個基因座可用于存在突變情形的二聯體、三聯體鑒定，也可用于因累積親權指數低于標準值[6]而不能明確鑒定意見的親權鑒定案件。

表6 6個基因座在實際案例中的排除率 （n=93）

[1]Schuler GD，Boguski MS，Stewart EA，et al.A gene map of the human genome[J].Science，1996，274（5287）：540-546.

[2]Walsh P S，Metzger D A，Higuchi R.Chelex-100 as a medium for simple xtraction of DNA for PCR-based typing from forensic materia[J].Biotechniques，1991，10：506-513.

[3]Lincoln P J.DNA recommendations-further report of the DNA Commission of the ISFH regarding the use of short tandem repeat systems.Forensic Sci Int.1997 Jun 23，87（3）：181-184.

[4]B?r W，Brinkmann B，Budowle B，et al.DNA recommendations.Further report of the DNA Commission of the ISFH regarding the use of short tandem repeat systems.International Society for Forensic Haemogenetics[J].Int J Legal Med，1997，110（4）：175-176.

[5]Promega Biotech Co.，Ltd.Powerstates V12.xls.[EB/OL] http：//www.promega.com/geneticidtools/.

[6]司法部司法鑒定技術規范[S].SF/Z JD0105001-2010.