腸道病毒EV71相關受體在人二倍體細胞KMB17表面的構成分析

劉馨，廖云

腸道病毒 EV71 主要感染消化道和呼吸道，然后通過血管運送至其他器官產生病毒血癥。在病毒與血管平滑肌細胞的相互作用過程中，可以導致血管壁細胞的壞死和血管炎。這種炎癥的產生，與病毒上調或抑制某些基因的表達，從而誘導產生的急性免疫反應有關。EV71 上調血管細胞間黏附分子VCAM-1 表達，在小鼠血管平滑肌細胞中，EV71感染可通過誘導血小板衍生生長因子受體（platelet derived growth factor receptor，PDGFR）磷酸化，而刺激 VCAM-1 的表達[1]。另外的研究發現，EV71感染人微血管壁細胞后，能夠誘導 Toll 樣受體 4（Toll like receptor，TLR4）的表達[2]。

人二倍體細胞 KMB17 是理想的疫苗生產用細胞基質，腸道病毒 EV71 能適應于 KMB17 細胞，并產生裂解性感染。KMB17 細胞表面 EV71相關的受體構成情況如何？這些受體的構成是否與 EV71 病毒能有效適應于 KMB17 細胞有關？為了回答上述兩個問題，本文選用了與 EV71 感染相關的 TLR4 和 PDGFR-αR1 兩種細胞表面受體作為研究對象，利用流式細胞分析（FACS）、實時定量 PCR（real-time PCR）等技術對這兩種受體在KMB17 細胞表面的表達情況以及受體特異的mRNA 片段進行了檢測，分析了不同細胞代次、不同細胞周期時段及病毒感染前后這兩種受體的表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑材料 KMB17 細胞、EV71 病毒株為中國醫學科學院醫學生物學研究所保存；單克隆抗體 PDGFR-αR1（FITC 標記，sc-32287）、TLR4（PE標記，sc-13593）購自美國 Santa Cruz公司。SYBR Premix Ex Taq? II、Prime-script RT-PCR 試劑盒、碘化丙啶（PI）、Trizol 購自大連寶生物工程有限公司；DMEM 培養基購自美國 Hyclone 生物技術公司。

1.1.2 儀器 Prism 7500 實時定量 PCR 儀購自于美國 ABI 公司；FACSCanto II 流式細胞儀為美國 BD 公司的產品。

1.2 方法

1.2.1 PCR 引物 使用 NCBI Primer-BLAST 設計了 PDGFR-αR1、TLR4 特異基因片段的引物，由上海生工科技有限公司合成，序列分別如下：

PDGFR-αR1 上游：5’ CATGTCTGAAGAAGA GAGCTCCGAT 3’；PDGFR-αR1 下游：5’ AGTTGT GCGACAAGGTATAATGGCA 3’；TLR4 上游：5’ A CTTATCAATGCATGGAGCTGAATT 3’；TLR4 下游：5’ TTCTGTAAACTTGATAGTCCAGAAA 3’。同時設立了 β-actin 引物：β-actin-S：CTCTTCCAG CCTTCCTTCCT；β-actin-AS：AGCACTGTGTTGG CGTACAG，片段大小為 116 bp。

1.2.2 KMB17 細胞周期的檢測 使用血清饑餓法進行細胞周期的同步化，用0.1% 的 PI 染色后，對不同細胞周期時段的 KMB17 細胞中的 DNA進行染色和流式細胞分析。具體如下：細胞傳代后，長至 30% 左右，將培養基更換為無血清培養基，24 h 后，再加入血清培養。以血清饑餓后，再次加入血清培養的時間作為 0 點，按 6、12、24、30、48、60、72 h 分別取 KMB17 細胞進行 PI 染色和檢測。按 106個/ ml細胞重懸細胞，使用 95% 乙醇于 4 ℃ 固定 1 h 后，離心去除乙醇，用 50 μg/ml的 RNaseA 于 37 ℃ 作用 30 min，PBS 清洗后加入 1 ml PI，于 4 ℃ 染色 30 min 后，清洗，用500 μl PBS 重懸后檢測。

1.2.3 不同周期時段 KMB17 細胞表面 EV71 相關受體檢測 取不同細胞周期時段的等量（106個）KMB17 細胞，用上述相關的抗體直接標記后，做流式細胞分析。

1.2.4 不同代次 KMB17 細胞表面 EV71 相關受體檢測 用如上方法，對第 23、25、27、28、30、31 和 33 代的 G0/G1 期 KMB17 細胞進行了檢測。

1.2.5 EV71 感染前后相關受體表達的變化 用EV71 病毒接種第 27 代 KMB17 細胞，使 m.o.i =1，吸附 0.5 h 后，加入有 5% 血清的 DMEM 培養基培養 12 h 后，按上述方法用熒光抗體標記，進行 FAC 檢測，與未感染病毒的細胞進行比較。

1.2.6 Real time PCR檢測 提取不同細胞周期的KMB17 細胞的 RNA，用 oligo DT 通用引物合成cDNA，以上述引物進行 real-time PCR 反應。具體反應步驟按相關的說明書操作。

2 結果

圖 1 血清饑餓法同步化后不同時間點 KMB17 細胞的 PI染色檢測細胞周期時間段（A：G0/G1 期；B：S 期；C：G2/M期）Figure 1 PI-stain at different time points of KMB17 cells released from serum starvation synchronization. (A: G0/G1 phase; B: S phase; C:G2/M phase)

圖 2 流式細胞儀檢測第 27 代 KMB17 細胞在 EV71 感染前后表達 TLR4 和 PDGFR-αR1 的陽性細胞比率（A：使用PE 標記抗 TLR4 抗體，感染前 12 h；B：使用 PE 標記抗 TLR4 抗體，感染后 12 h；C：使用 FITC 標記抗 PDGFR-αR1抗體，感染前 12 h；D：使用 FITC 標記抗 PDGFR-αR1 抗體，感染后 12 h）Figure 2 Anti-PDGFR-αR1-FITC mAb or anti-TLR4-PE mAb marked the 27th passage KMB17 cells detected by FAC before or after EV71 infection (A: PE conjugated anti-TLR4 Ab, 12 hours before infection; B: PE conjugated anti-TLR4 Ab, 12 hours post infection; C: FITC conjugated anti-PDGFR-αR1 Ab, 12 hours before infection; D: FITC conjugated anti-PDGFR-αR1 Ab, 12 hours post infection)

利用流式細胞儀研究了 KMB17 細胞的周期，對不同周期時段細胞表面的 TLR4、PDGFR-αR1的表達情況進行了檢測；利用 real-time PCR 對不同細胞周期時段 TLR4、PDGFR-α 特異的 mRNA片段進行了檢測。使用流式細胞儀一共做了 18 次檢測，研究表明，KMB17 細胞在使用血清饑餓法進行 G0/G1 同步化后約 22 h 進入 S 期，在 36 h左右進入 G2 期，在 48 h 左右完成分裂。PDGFR-αR1、TLR4 平均陽性細胞的比例分別為 4.47% 和11.82%；不同細胞周期時段、細胞的不同代次對2 種受體陽性細胞的比例影響不大；EV71 病毒感染后，PDGFR-αR1 及 TLR4 陽性的細胞比率無明顯變化。

2.1 KMB17 的細胞周期

KMB17 細胞在使用血清饑餓法進行 G0/G1同步化后，約 22 h 進入 S 期，約 36 h 進入 G2期，在 48 h 左右完成分裂。于是將 KMB17 的細胞周期初步的劃分為：G0/G1 同步化后，0 ～ 22 h為 G0/G1 期，22 ～ 36 h 為 S 期，36 ～ 54 h 為G2/M 期。在這 3 個時段，分別取 6、24、48 h 三個點作為檢測點（圖 1）。

2.2 不同周期時段 KMB17 細胞表面 EV71 相關受體的表達

在 G0/G1 期，通過 FACS 檢測，PDGFR-αR1、TLR4 的平均陽性細胞比例分別為 4%、8.9%；在S 期，分別為 2.6%、9%；在 G2/M 期，分別為4.4%、13.5%。

2.3 不同代次 KMB17 細胞表面 EV71 相關受體檢測

使用了第 23、24、25、27、28、30、31 和33 代的 KMB17 細胞。不同代次細胞表達 2 種受體的陽性細胞率差別不大。

2.4 EV71 感染前后相關受體表達的變化

EV71 感染后處于 G0/G1 期的第 27 代KMB17 細胞（感染前記為 27b，感染后記為 27a），PDGFR-αR1 的陽性細胞比率有所上升，由 2.6%上升至 4.0%；TLR4 陽性細胞比率分別為 11.8%和 12.6%（圖 2）。

2.5 Real-time PCR檢測不同細胞周期時段各受體mRNA 的表達

使用 RT-PCR 檢測了 KMB17 細胞中 TLR4和 PDGFR-αR1 目的片段cDNA（圖 3，核酸電泳圖）。利用 real-time PCR 檢測了不同細胞周期時段，這 2 種受體 mRNA 的相對表達情況，在總RNA 保持恒定的情況下，PDGFR-αR1 與 TLR4的相對表達量（圖 4，圖 5）。

圖 3 RT-PCR 檢測人二倍體細胞中 TLR4 及 PDGFR-αR1 cDNA 片段Figure 3 cDNA fragments detection of TLR4 and PDGFR-αR1 in human diploid cell KMB17 by RT-PCR

圖 4 Real-time PCR 檢測不同細胞周期 KMB17 細胞中PDGFR-αR1（A）和 TLR4（B）cDNA 片段的相對量Figure 4 Relative quantity of PDGFR-αR1 (A) and TLR4 (B)cDNA fragmentS in KMB17 cells of different cell cycle phases detected by real-time PCR

3 討論

根據 GENECARDS（http://www.genecards.org）數據庫資料，人肺組織表達 PDGFR、TLR4、integrins 等受體，其中 PDGFR、TLR4 與腸道病毒 EV71 的感染相關。疫苗生產用 KMB17 細胞是來自于人胚肺的二倍體細胞，不同的病毒對KMB17 細胞的適應能力存在差異，而腸道病毒EV71 能夠有效地在 KMB17 細胞上產生裂解性增殖，可能與細胞表面表達相應的受體有關。本文的研究表明 KMB17 細胞表面表達 PDGFR-αR1、TLR4 這兩種受體；在 KMB17 細胞的生產許可代次（23 ～ 33 代）之內，表達兩種受體的細胞陽性率差異不明顯；PDGFR-αR1 在 G0/G1 期表達較高，TLR4 在 G2/M 期表達較高。EV71 感染后，表達 PDGFR-αR1、TLR4 的陽性細胞率有所上升，但差異不大。文獻[2]報道 EV71 感染后誘導TLR4 在人微血管壁細胞表達，但在 KMB17 細胞中沒有觀察到明顯的 TLR4 表達的變化，這可能與這兩者細胞類型的不同有關。

同時我們檢測了 G0/G1 期人二倍體細系WI38 表面的 TLR4 和 PDGFR-αR1 的表達情況，分別為 15.7% 和 1.7%，人二倍體細胞系 IMR90表面的 TLR4 和 PDGFR-αR1 的表達情況，分別為 4.6% 和 7.4%，存在一定的差異，但兩種受體在不同的人二倍體細胞中相對量多寡一致。

圖 5 Real-time PCR 循環圖Figure 5 Real-time PCR cycle

根據報道，A1、A2 型腺苷受體（A1 adenosine，A2 adenosine）的拮抗劑在人肌肉瘤細胞上有抗EV71 復制子增殖的作用[3]。我們使用 RT-PCR 沒有在 KMB17 細胞中檢測到 A1 Adenosine，A2 Adenosine 的特異的 mRNA 片段。

對 EV71 敏感的人橫紋肌肉瘤細胞（rhabdomyosarcoma cells）感染 EV71 后的mRNA 差異顯示分析表明，與細胞膜相關，又顯著變化的基因有 4 種膜蛋白：膜蛋白 RDEV064 180 BC002392，膜蛋白 palmitoylated 1（55 kD），Leukophysin（LKP）和神經元膜表面糖蛋白 M6b[4]。此外，EV71 還可通過DC-SIGN 的介導作用進入DC 細胞[5]。通過克隆表達法，對人 T 細胞 cDNA文庫的篩選發現，CD126（human P-selectin glycoprotein ligand-1）是 EV71 病毒的功能性受體，但是這個受體是白細胞依賴性的，而且是病毒株型特異的[6]，在其他非白細胞中，EV71 不依賴于 CD126 也能進行復制[7]。

最近的研究認為人清道夫受體家族 scavenger receptor B2（SCARB2 CD36 like 2）是 EV71 的一個細胞受體[8-9]。與 PDGFR-αR1 和 TLR4 相比，不同的是 SCARB2 與 EV71 最初的感染識別關系更為密切，而 PDGFR-αR1 與 TLR4 只是在病毒感染后誘導的免疫反應過程中相關，因此，正如本研究顯示，在體外病毒的感染和繁殖過程中，由EV71 引起的這兩種受體蛋白的變化也相對有限。對疫苗生產用人二倍體細胞 KMB17 而言，檢測與病毒識別密切相關的受體蛋白的構成，如新近發現的 SCARB2，將更有助于闡明在生產應用實際過程中該細胞對不同的病毒的敏感性存在差異的問題。

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