增強型綠色熒光蛋白基因與輪狀病毒VP6基因融合表達載體的構建及表達

潘小霞，張順，袁靜，文喻玲，陳元鼎

輪狀病毒（rotavirus，RV）屬于呼腸病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬，是引起嬰幼兒急性胃腸炎的主要病原體，每年死于 RV 感染者多達 61 萬余人[1]。RV 由三層蛋白組成：核心衣殼由各含12 個分子的 VP1 蛋白（轉錄酶）和 VP3 蛋白（鳥苷酸轉移酶）及 120 個分子的 VP2 蛋白組成[2]；中間層衣殼由 780 個分子的 VP6 蛋白組成，VP6是病毒的組（亞組）抗原蛋白；外層衣殼由兩個具有中和抗原性的 VP4 和 VP7 蛋白組成，各含有180 個和 780 個分子。根據 VP6 蛋白抗原性差異，可將 RV 分為 A ～ G 等 7 個組，其中 A 組RV 是嬰幼兒急性胃腸炎的主要病原體。根據編碼框（open reading frame，ORF）核苷酸序列同源性差異，至少可以將 A 組 RV 的 VP6 分為 14 個不同的基因型[3]。雖然 VP6 蛋白不是病毒轉錄酶，但 VP6 蛋白的存在對病毒的轉錄必不可少。此外，VP6 蛋白在維持病毒形態、病毒進入細胞和組裝過程中起物理受體的作用。病毒進入宿主細胞后，外殼蛋白的缺失和形成表層為 VP6 蛋白的兩層病毒顆粒（double-layered particle，DLP）是轉錄產生mRNA 所必需的[4-5]。大量實驗證明，VP4 和 VP7蛋白并非是免疫保護反應的唯一抗原，RV 中殼蛋白 VP6 也能刺激機體產生免疫保護反應。但這些試驗都是在小鼠模型中完成的，如果能證實 VP6在人體內也具有安全有效的保護作用，那么研究并發展以 VP6 為基礎的疫苗會具有很好的應用前景[6]。

綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）是較好的活體分子標志物，易與目的基因形成融合蛋白且不影響自身目的基因產物的空間構象和功能。對多數宿主的生理無影響，不需依賴任何輔助因子或其他基質就能在紫外線下激發出性質穩定易檢測的熒光。通過改造獲得的增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein，EGFP）是 GFP 的一個突變體，熒光強度更高，光漂白抗性更強。

本實驗通過構建 RV VP6 蛋白基因與 EGFP蛋白基因融合表達載體并轉染到恒河猴腎傳代細胞 MA104 細胞中，EGFP 與目的基因 VP6 融合標記為綠色，在熒光顯微鏡下觀察 VP6 基因的蛋白表達水平及其在細胞內的分布情況和表達量的變化，為探討 VP6 基因在結構功能及免疫保護作用方面奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞株、病毒和質粒 大腸桿菌DH5α、質粒載體 pBS（pBluescript K/S）、恒河猴腎傳代細胞 MA104（用含 10% 的新生牛血清MEM 營養液培養）由本實驗保存；真核表達質粒pEGFP-C1 購自日本 Clontech 公司；TB-Chen 株病毒由本實驗室自 2 歲齡急性胃腸炎患者的大便樣品中分離得到，由本實驗室保存。

1.1.2 工具酶和生化試劑 LA Taq DNA 聚合酶、DNA 限制性核酸內切酶、T4 DNA 連接酶均購自日本 TaKaRa 公司；脂質體 Lipofectamine? 2000購自美國 Invitrogen 公司；MEM 培養基購自美國Sigma 公司；引物合成及序列測定由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.1.3 主要儀器 Biofuge 15R 型低溫冷凍離心機購自德國 Heraeus 公司；Nikon E600 型熒光顯微鏡、DXM1200 型數字照相機購自日本尼康公司；ImageMasterR VDS 型數字成像儀購自美國Pharmacia Biotech 公司。

1.2 方法

1.2.1 融合表達質粒的構建

1.2.1.1 引物設計 試驗所用 TB-Chen 株病毒為 A 組 RV，其基因型為 G2-P[4]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2/h2[7-9]。VP6 基因克隆自基因組中編碼 VP6 的第 6 基因，該基因全長為 1356 bp，編碼 397 個氨基酸，蛋白分子量約為 45 kD。基因全長核苷酸及編碼氨基酸序列見 GenBank（Accession number：AY787645）。VP6 基因經基因重組克隆到質粒 pBS 上。根據 VP6 基因核苷酸序列設計并合成引物。上游引物為 5’ ATC CGCGGAGCTCCACCGCGGTGGC 3’，下游引物為5’ GTGGATCCTATTACGGGCCCGTACCGTCG 3’。上游引物和下游引物中分別引入限制性核苷酸內切酶位點 Sac （IGAGCTC）和 BamH （IGGATCC）。

1.2.1.2 TB-Chen VP6 基因的擴增 PCR 反應混合液體積為 100 μl，含有 30 ng 模板 DNA（攜帶 VP6 全基因的 pBS-VP6 質粒 DNA），60 pmol/L dNTPs，10 μl 10 × PCR 緩沖液，5 U Taq DNA 聚合酶，60 pmol/L 上游引物，60 pmol/L 下游引物。反應條件為 94 ℃ 預變性 3 min；94 ℃ 變性 40 s，56 ℃ 復性 40 s，72 ℃ 延伸 1 min，擴增 40 個循環；最后，72 ℃ 反應 10 min。取 5 μl PCR 擴增產物在 1.5% 的瓊脂糖凝膠（含 0.5 μg/ml 溴乙錠）中電泳檢測，回收目的擴增片段。

1.2.1.3 融合基因的連接和表達質粒的篩選 PCR 擴增的 VP6 基因片段及載體 pEGFP-C1質粒 DNA 分別用 Sac I 和 BamH I 雙酶切后，目的基因片段和質粒載體片段在 T4 DNA 連接酶的作用下連接。連接產物轉化至大腸桿菌 DH5α感受態細胞中。將轉化產物涂布于含卡那霉素（30 mg/L）的 LB 平板培養。挑取單個菌落進行質粒擴增、堿裂解法制備重組質粒和酶切鑒定。重組質粒最后經核苷酸序列測定確定。

1.2.2 融合蛋白在 MA104 細胞中的表達 轉染前一天，將 MA104 細胞接種到 12 孔細胞培養板中（5 × 104個/孔，內裝有蓋玻片）。轉染時，蓋玻片上的 MA104 細胞單層用不含抗生素的 PBS 洗液洗 3 次，加入不含抗生素和新生牛血清的 MEM生長培養基，每孔 800 μl；將 1.6 μg 質粒 DNA 稀釋在 100 μl 不含抗生素和小牛血清的生長培養基中，輕輕混勻；將 4 μl 的脂質體 Lipofectamine?2000 稀釋在 100 μl 的不含抗生素和新生牛血清的生長培養基中，輕輕混勻后在室溫下孵育 5 min；將稀釋的質粒 DNA 和脂質體 Lipofectamine?2000 混合，總體積為 200 μl，輕輕混勻，室溫孵育 20 min，形成脂質體復合物。將脂質體復合物加到含細胞和培養基的孔中，每孔 200 μl，輕輕地前后搖動培養板，混勻，于 37 ℃， 5% CO2培養箱孵育 4 ～ 6 h 后，吸出吸附液，加入 1 ml 含抗生素和 10% 小牛血清的 MEM 培養液。轉染后不同時間，在熒光顯微鏡下檢測融合蛋白的表達結果。

2 結果

2.1 VP6 基因編碼序列的 PCR 擴增

以攜帶 VP6 全基因的質粒 pBS-VP6 為模板擴增 VP6 基因后，在 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳中檢測，在預期位置（1116 bp）檢測到一擴增產物條帶，大小正確（圖 1）。

圖 1 VP6 基因的 PCR 擴增Figure 1 PCR of VP6 gene

2.2 融合表達質粒 pEGFP-VP6 的構建

VP6 的 PCR 回收產物及載體 pEGFP-C1 質粒 DNA 經過 Sac I 和 BamH I 雙酶切后，在 T4 DNA 連接酶的作用下連接，然后轉化到 DH5α 感受態細胞。經堿裂解法提取重組質粒。重組質粒進行 Sac I/BamH I 酶切鑒定（圖 2）。酶切鑒定后的pEGFP-VP6 進行雙向核苷酸序列測定。結果表明，插入表達質粒 pEGFP-C1 上的 VP6 編碼基因序列完整，方向正確，融合表達質粒 pEGFP-VP6 構建成功。

圖 2 重組質粒 pEGFP-VP6 的酶切鑒定Figure 2 Identification of expression plasmid pEGFP-VP6

2.3 融合蛋白 EGFP-VP6 在 MA104 細胞中不同時間的表達

融合表達載體 pEGFP-VP6 及綠色熒光蛋白載體 pEGFP-C1 轉染 MA104 細胞后，在熒光顯微鏡下觀察，并以未轉染的細胞做空白對照。結果顯示，融合蛋白 EGFP-VP6 分布于細胞質中，呈較均勻的分布狀態（圖 3B），與 RV 感染細胞中合成的 VP6 蛋白在細胞質中形成毒質體（viroplasma）樣結構有較大的差別[10]。細胞核中沒有觀察到融合蛋白。綠色熒光蛋白載體pEGFP-C1 的轉染效率較高，熒光蛋白均勻分布于整個 MA104 細胞中（包括細胞核）（圖 3C）。在轉染 3 h 后，即可觀察到細胞發出熒光，隨著時間的延長，發出熒光的細胞不斷增多，熒光強度增強，圍繞細胞核向周圍彌散擴散，在轉染 21 h 后，蛋白表達穩定，轉染 27 ～ 39 h 之間，熒光最多。72 h后，熒光淬滅，細胞形態消失（圖 4）。未轉染的對照細胞沒有檢測到熒光。

3 討論

VP6 作為 RV 的組和亞組抗原蛋白在病毒株的分類鑒定上具有重要意義[11]，作為疏水性蛋白的VP6 蛋白也具有較強的抗原反應性和免疫原性[12]。另外，在小鼠模型中用 VP6 蛋白或 VP6 蛋白編碼 DNA 免疫能產生體內保護[4,12-14]。有佐劑的條件下，無論是口服、鼻腔免疫還是腸道免疫，VP6 蛋白疫苗都能有效降低或防止 RV 排出。同時 VP6蛋白也具有 CD4+T 細胞表位和交叉反應的細胞毒性 T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）表位，以 VP6 蛋白作為疫苗抗原或疫苗基質可能會有較好的應用前景。

研究表明，在有佐劑 LT（R192G）條件下，使用麥芽糖結合 VP6 蛋白（MBP::VP6）鼻腔免疫小鼠，發現幾乎所有的免疫小鼠都能免受 RV EDIM 株的攻擊，排毒水平降低 ＞ 98%，遠遠大于MBP::VP4 或 MBP::VP7 的保護作用[15]。Feng等[4]研究發現，VP6 蛋白特異性 IgA 單克隆抗體，如 7D9 可以使 SCID 小鼠免受 RV 感染，并能清除 RV 慢性感染。認為 VP6 蛋白的特異性單克隆抗體通過與 VP6 蛋白結合后引起 VP6 蛋白三聚體構象發生變化，處于核心的病毒 RNA 聚合酶活性降低，從而使病毒顆粒失去了轉錄活性，在病毒復制循環過程的一開始就阻止了病毒在細胞內的轉錄復制。

在小鼠體內，眾多的實驗表明，經 RV 的 VP6蛋白免疫動物后在動物體內確實能引起抗 RV 感染的作用，但目前對 VP6 蛋白的免疫保護機制還不是很清楚。VP6 蛋白誘導機體產生的 IgA 在跨細胞轉運中可能和小腸上皮細胞中缺失外殼蛋白的 RV 顆粒相互作用進而在細胞內中和病毒[4]，也可能是 VP6 抗體和 VP6 蛋白結合后阻斷了 VP6蛋白與細胞上受體的相互作用，或誘導病毒顆粒發生構象變化，使病毒不能吸附到宿主細胞上。對于抗 VP6 抗體的具體保護機制仍有待進一步的研究。

圖 3 重組質粒 pEGFP-VP6 在 MA104 細胞中的表達（A：未轉染的 MA104 細胞對照；B：融合表達載體 pEGFP-VP6 轉染 MA104 細胞；C：綠色熒光蛋白載體質粒 pEGFP-C1 轉染 MA104 細胞）Figure 3 The expression of recombinant plasmid pEGFP-VP6 in MA104 cells (A: The no-transfected cells; B: The cells transfected with plasmids pEGFP-VP6; C: The cells transfected with plasmids pEGFP-C1)

圖 4 融合蛋白 EGFP-VP6 在 MA104 細胞中不同時間的表達情況（A：3 h；B：9 h；C：15 h；D：21 h；E：27 h；F：33 h；G：39 h；H：72 h）Figure 4 Analysis of fusion protein EGFP-VP6 expression in MA104 cells at 3 h (A), 9 h (B), 15 h (C), 21 h (D), 27 h (E), 33 h (F),39 h (G), 72 h (H) transfection with plasmid pEGFP-VP6

pEGFP-C1 是一個能表達增強型綠色熒光蛋白的質粒，由人工合成和優化且適于哺乳動物細胞的表達，主要用于判定轉基因的效率和目的基因定位，以及目的基因表達與功能關系的研究。在本實驗中，我們以攜帶 VP6 全基因的質粒 pBS-VP6 為模板擴增 VP6 基因，將擴增片段雙酶切后連接到質粒 pEGFP-C1 中，構建重組表達載體 pEGFP-VP6，并用脂質體的方法轉染到恒河猴腎細胞 MA104中。在轉染 3 h 后，即可觀察到細胞發出熒光，蛋白分布在胞質中，但并沒有像 RV 感染細胞中合成的 VP6 蛋白可在細胞質中形成毒質體樣結構[10]。該結果提示，由于沒有其他 RV 成分的相互作用，與 EGFP 融合表達的 VP6 蛋白沒有處于參與轉錄或組裝過程中物理受體的狀態。本研究通過綠色熒光蛋白的示蹤技術，證實了 VP6 基因在真核細胞中的表達及分布狀況，并為進一步研究 VP6 基因的功能及作用機制奠定了基礎。

[1] Parashar UD, Gibson CJ, Bresse JS, et al. Rotavirus and severe childhood diarrhea. Emerg Infect Dis, 2006, 12(2):304-306.

[2] Estes MK, Cohen J. Rotavirus gene structure and function. Microbiol Rev, 1989, 53(4):410-449.

[3] Chen YD, Fan YC, Li CY. Classification and nomenclature for rotaviruses. Int J Virol, 2009, 16(4):115-120. (in Chinese)陳元鼎, 范耀春, 李傳印. 輪狀病毒分類與命名. 國際病毒學雜志,2009, 16(4):115-120.

[4] Feng N, Lawton JA, Gilbert J, et al. Inhibition of rotavirus replication by a non-neutralizing, rotavirus VP6-specific IgA mab. J Clin Invest,2002, 109(9):1203-1213.

[5] Ayala-Breton C, Arias M, Espinosa R, et al. Analysis of the kinetics of transcription and replication of the rotavirus genome by RNA interference. J Virol, 2009, 83(17):8819-8831.

[6] Pan XX, Zhang S, Chen YD. Advances in Study on the VP6 of Rotavirus. Chin J Vaccines and Immunization, 2011, 17(2):176-179.(in Chinese)潘小霞, 張順, 陳元鼎. 輪狀病毒VP6蛋白的免疫學研究進展. 中國疫苗和免疫, 2011, 17(2):176-179.

[7] Chen Y, Wen Y, Liu X, et al. Full genomic analysis of human rotavirus strain TB-Chen isolated in China. Virology, 2008, 375(2):361-373.

[8] Wen YL, Li CY, Fan YC, et al. NSP5/NSP6 of rotavirus strain TB-Chen and Preliminary genotyping analysis. Chin J Virol, 2009,25(5):354-358. (in Chinese)文喻玲, 李傳印, 范耀春, 等. TB-Chen株輪狀病毒NSP5/NSP6及基因型研究. 病毒學報, 2009, 25(5):354-358.

[9] Chen YD, Liu X, Xiong XY, et al. Cloning of full genome and genotyping of a group A human rotavirus. China Biotechnol, 2008,28(2):25-31. (in Chinese)陳元鼎, 劉曉, 熊新宇, 等. A組人輪狀病毒全基因組克隆和基因型分析. 中國生物工程雜志, 2008, 28(2):25-31.

[10] Yin XX, Wen YL, Zhao QH, et al. Immunofluorescence assay of rotavirus VP6 protein. Chin J Biologicals, 2008, 21(5):434-437.(in Chinese)尹興曉, 文喻玲, 趙慶歡, 等. 輪狀病毒VP6蛋白的免疫熒光檢測.中國生物制品學雜志, 2008, 21(5):434-437.

[11] Greenberg H, McAuliffe V, Valdesuso J, et al. Serological analysis of the subgroup protein of rotavirus using monoclonal antibodies. Infect Immun, 1983, 39(1):91-99.

[12] Yang K, Wang S, Chang KO, et al. Immune responses and protection obtained with rotavirus VP6 DNA vaccines given by intramuscular injection. Vaccine, 2001, 19(23-24):3285-3291.

[13] VanCott JL, Prada AE, McNeal MM, et al. Mice develop effective but delayed protective immune responses when immunized as neonates either intranasally with nonliving VP6/LT(R192G) or orally with live rhesus rotavirus vaccine candidates. J Virol, 2006, 80(10):4949-4961.

[14] Dennehy M, Bourn W, Steele D, et al. Evaluation of recombinant BCG expressing rotavirus VP6 as an anti-rotavirus vaccine. Vaccine,2007, 25(18):3646-3657.

[15] Choi AH, McNeal MM, Basu M, et al. Intranasal or oral immunization of inbred and outbred mice with murine or human rotavirus VP6 proteins protects against viral shedding after challenge with murine rotaviruses. Vaccine, 2002, 20(27-28):3310-3321.