從人源大容量天然抗體庫中篩選到抗禽流感病毒 H5N1單鏈抗體＊

孫麗娜,于 禮,張 黎 ,李 川 ,李德新 ,梁米芳

抗體庫的種類可分為免疫抗體庫和非免疫抗體庫,免疫抗體庫技術是指從經過抗原免疫的動物血液淋巴細胞中分離針對抗原的抗體基因的技術;非免疫抗體庫包括天然大容量抗體庫和合成抗體庫,它是一種不經過免疫就能獲得針對某種抗原的基因工程抗體的技術[1]。最早建立的天然庫以兩個正常人外周血淋巴細胞為材料,初步篩選出針對三種不同抗原的抗體[2]。對于一些自身免疫原引起的疾病(如癌癥、自身免疫疾病和心血管疾病)以及快速獲得突發新發傳染病治療或診斷用抗體的應急儲備庫,非免疫抗體庫尤其是天然抗體庫技術顯示了良好的應用前景[3]。

禽流感病毒是一種球形或桿狀、有包膜的單股負鏈 RNA病毒,屬于正黏病毒科流感病毒屬A型流感病毒,其基因組分為8個節段。病毒囊膜表面的跨膜糖蛋白血凝素蛋白(HA)和神經氨酸酶蛋白(NA)是流感病毒的主要免疫原性抗原。HA識別靶細胞表面受體并與受體相結合,具有與宿主細胞膜融合活性,能夠誘導機體產生保護性中和抗體[4-5]。有研究表明人源及人源化中和性抗禽流感病毒 H5N1單克隆抗體對小鼠有良好保護和治療效果[6-7]。因而,從人源大容量天然抗體庫中利用高通量的篩選策略在短時間內獲得抗禽流感病毒H5N1人源單抗,對于新發傳染病的緊急預防和治療是十分必要和可行的。本研究利用人源大容量天然抗體庫,采用噬菌體表面展示技術,以 H5N1禽流感病毒安徽株 HA為抗原,最終得到了5株針對HA的噬菌體抗體基因,為高致病性禽流感病毒H5N1的預防和治療帶來了希望。

1 材料與方法

1.1 材料 人源大容量天然抗體庫 HAL4/7由德國布倫瑞克大學生物技術研究所構建[8],該抗體庫庫來源于44個健康人淋巴細胞,容量為5×109,抗體庫篩選時投入2個分開構建并用高效噬菌體Hyperphage包裝的抗體庫子庫[9],分別為5×1012HAL4庫即為VL kappa型和5×1012HAL7庫,即為VL lambda型(重鏈為 VH1,VH2,VH3,VH4,V H5,VH6混合分別與kappa和lambda輕鏈庫混合構建)。攜帶人源 Fc段的表達載體 pCMV-hIgG1-Fc-XP由德國布倫瑞克大學生物技術研究所構建并惠贈[10]。MDCK細胞及293T細胞來自美國細胞培養中心(A TCC)。禽流感病毒 A/Anhui/1/2005(H5N1)及人流感病毒 A/Hubeihs/53/2005(H1N1)和A/Yunnan/1145/2005(H3N2)感染MDCK細胞后制成病毒抗原片以及昆蟲-桿狀病毒重組表達的禽流感血凝素蛋白 HA(A/Anhui/1/2005)抗原片均由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所提供并保存,詳見參考文獻[11]。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體抗體庫的富集篩選 富集篩選方法基本按文獻[12]進行,具體如下:用 1×PBS(p H 7.2)的溶液包被純化的 HA 抗原(2μg/孔),每孔150μl,4℃過夜;次日用 4%的BSA蛋白溶液于37℃封閉 2 h,棄封閉液;每孔加入 150μL噬菌體抗體庫,37℃孵育2 h,棄去未結合的噬菌體,用1×PBST(1×PBS,0.5%Tween 20,p H 7.2)充分洗去未吸附的噬菌體10～30遍;每孔加入 150μL Gly-HCl(p H2.2)的洗脫液,室溫震蕩洗滌 10 min。加入適量的2 mol/L Tris,以中和洗脫下來的噬菌體;將洗脫的噬菌體立即加入 5 mL新鮮制備的XLI-Blue菌液中(OD600=0.7),靜置15～20min;37℃震蕩培養1 h,立即取10μL涂2YT-GA(終濃度100μg/mL氨芐青霉素,20 mmol/L葡萄糖)平板,以計算產出量;其余涂2YT-GA平板,37℃過夜培養。次日將平板上長出的細菌刮下,取刮下的細菌加入到100 ml的2YT-GA液體培養基中使OD600=0.3,繼續培養使 OD600=0.5,加入輔助噬菌體M13K07(滴度為 1012/mL)200μL,37℃靜置 15～20 min,800 r/min振蕩培養 1 h,加入卡那霉素(終濃度70μg/mL),30℃培養過夜。如此反復篩選3次。

1.2.2 scFv噬菌體抗體結合活性的phage-ELISA檢測 挑取單個克隆到150μL 2YT-GA液體培養基的深孔板于 37℃培養過夜,第2d轉接菌液10μL到150μL 2YT-GA液體培養基37℃培養2 h,加入 M13K07使MOI達到20∶1,37 ℃靜置15 min,37℃800r/min搖1 h,補加1倍體積的2YTGA液體培養基,加入卡那霉素(終濃度70μg/mL)30℃過夜培養,培養液離心后得到的上清用來檢測。用0.1mol/L NaHCO3(p H 9.6)的溶液包被HA抗原,125ng/孔,4℃過夜;4%脫脂奶封閉,37℃1 h,加入呈現的 scFv噬菌體抗體,37℃孵育1 h;加入酶標抗M 13二抗(美國 Sigma,1∶4 000稀釋使用),37℃1 h;顯色液顯色,2 mol/L H2SO4終止反應,酶標儀檢測吸光度A450值。

1.2.3 單鏈抗體 scFv基因序列分析 經過phage-ELISA特異性鑒定得到的針對 HA的陽性克隆進行測序,測序的結果用DNASTAR序列分析軟件進行分析,然后用Mega3.0對序列進行 ClustalW分析,對相同的序列進行合并,對合并后的序列與V-Base基因庫中的 IgG序列進行比較。

1.2.4 scFv-Fc抗體重組表達質粒的構建與表達

挑選phage-ELISA針對 HA特異性鑒定陽性克隆,經NcoI/N otI雙酶切,克隆入攜帶人源 Fc段的表達載體 pCMV-hIgG1-Fc-XP[11],構建成 scFv-Fc融合抗體表達載體。采用LipofectamineTM 2 000試劑盒(美國,Invitrogen)轉染293T細胞,操作方法略述如下:將 0.8～1μg重組質粒 DNA加入50μLOPTIMEMI 中,然 后 將 2 ～ 3μLLipofectamine試劑加入 50μL OPTIMEMI中,5min后兩者混合均勻,室溫放置20min。將混合好的含目的質粒及Lipofectamine的混合液輕輕加入到清洗過的細胞密度達到90%～95%單層293T細胞中,輕輕混勻后37℃,CO2培養箱中培養6h后,加入含10%小牛血清的DMEM完全培養基,轉染后48h,收獲細胞,用免疫熒光(IFA)檢測。

1.2.5 ELISA檢測scFv-Fc抗體與抗原的結合特異性 用0.1 mol/L NaHCO3(p H9.6)的溶液包被純化 HA(A/Anhui/1/2005)和滅活 H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/2005),4℃過夜;4%脫脂奶封閉,37℃1 h,加入 scFv-Fc抗體表達上清,37℃孵育1 h,加入酶標抗人Fc二抗(美國 Sigma,1∶2 000稀釋),37℃1 h;顯色液顯色,2 mol/L H2SO4終止反應,酶標儀檢測吸光度 A450值。

1.2.6 間接免疫熒光(IFA)檢測 scFv-Fc抗體與抗原的結合特異性 高致病性禽流感病毒 A/Anhui/1/2 005(H5N1)及人流感病毒A/Hubeihs/53/2005(H1N1)和A/Yunnan/1145/2005(H3N2)感染MDCK細胞后制成病毒抗原片;同時利用已構建的表達禽流感血凝素蛋白 HA(A/Ahui/1/2005)重組桿狀病毒感染 Sf9細胞,4～5d后收獲感染細胞制成重組 HA抗原片。加入scFv-Fc抗體表達上清,37℃溫育 30 min,沖洗,加入FITC標記的抗 Fc抗體(美國 Sigma),37℃溫育30 min,沖洗,晾干,顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1 人源大容量天然抗體庫的富集篩選 用純化的 H5N1禽流感病毒 HA抗原(A/Anhui/1/2005)對天然人源抗體庫進行了3輪富集篩選。針對HA抗原,第一、二、三輪篩選分別產出 3.2×103,5.5×104,2.4 ×105個克隆,見表1。

表1 3輪篩選的產出量比較Tab.1 Phage antibody output in three rounds of screening

在第三輪富集的基礎上挑選 1 500個克隆,經phage-ELISA鑒定表明,針對 HA抗原得到82個陽性克隆,經測序表明這82個克隆分別屬于5個不同的抗體序列,即為5個唯一序列的抗體克隆。

2.2 人源抗禽流感病毒 H5N1 scFv單鏈抗體的序列分析 用DNASTAR、Mega3.0序列分析軟件進行分析處理,比較 Internet V-Base基因庫中的IgG序列,上述82株特異性結合 H5N1禽流感病毒HA的人源scFv單克隆抗體中,分別屬于5個不同的抗體序列,因此共發現5株帶有不同的抗體輕重鏈可變區序列及其組合的抗體,其重鏈可變區分類在 IgG V H1和 VH3家族,其輕鏈可變區分類在IgG VL1和 VL6家族。這 82株抗體中,有 47株相同序列的克隆命名為 AVFluscFv01,其余19株、7株、5株、4株相同序列的克隆分別名為 AVFluscFv04,AVFluscFv02,AVFluscFv03,AVFluscFv05,這5株抗體在篩選中的分布如圖 1,其輕重鏈可變區CDR3氨基酸序列見表2。

圖1 5株單鏈抗體在篩選中的分布Fig.1 The distribution of the 5 scFv antibodies against HA(A/Anhui/1/2005)in screening

表2 抗禽流感病毒scFv抗體輕重鏈可變區CDR3氨基酸序列Tab.2 Amino acid sequences of variable regions CDR3 in the Hand L chains of H5N1 virus-specific scFvs

2.3 人源抗 H5N1禽流感病毒scFv-Fc抗體的表達 將5株針對 HA陽性的克隆,經NcoI/NotI雙酶切,克隆入攜帶人源 Fc段的表達載體 pCMV-hIgG1-Fc-XP,轉染 293T細胞,實現 scFv-Fc抗體的分泌型表達,分別命名為AVFluscFv/Fc01、AVFluscFv/Fc02、 AVFluscFv/Fc03、 AVFluscFv/Fc04、AVFluscFv/Fc05,分泌表達載體的模式圖如圖2所示。轉染的293T細胞用FITC-抗人Fc抗體檢測,觀察到陽性熒光反應,表明 H5N1禽流感scFv-Fc抗體在293T細胞中得到完整表達,見圖2。

2.4 人源抗 H5N1禽流感病毒scFv-Fc抗體的結合特性 (ELISA檢測) 為了證明所獲得的重組抗體以 scFv-Fc融合抗體形式分泌表達后也能對H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/2005)及其HA抗原有特異性結合,我們將scFv-Fc重組質粒轉染293T細胞,收獲的表達上清,并利用 ELISA進行檢測。結果表明,最后獲得 5株scFv-Fc抗體能夠穩定而且特異性結合 H5N1禽流感病毒顆粒(A/Anhui/1/2005)及其 HA抗原,而與無關抗原BSA無交叉反應,結果見圖3。

圖2 免疫熒光檢測人源抗 H5N1禽流感病毒 scFv-Fc抗體的表達Fig.2 IFA detecting expression of scFv-Fc antibodyagainst avian influenza A(H5N1)virusA:Using FITC conjugated anti-human Fc to detect the anti-H5N1 scFv-Fc antibody;B: Normal 293T cells

圖3 ELISA檢測人源抗 H5N1禽流感病毒scFv-Fc抗體的結合特性Fig.3 ELISA test detecting binding of 5 scFv-Fc antibodies with H5N1 virus and HA

2.5 人源抗 H5N1禽流感病毒 scFv-Fc抗體的結合特性 (IFA鑒定) 為了證實所獲得的重組scFv-Fc融合抗體對禽流感病毒 H5N1的結合特異性,我們進一步通過間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定真核表達 scFv-Fc融合抗體的功能活性。結果表明,5株人源 scFv-Fc抗體(AVFluscFv/Fc01、AVFluscFv/Fc02、 AVFluscFv/Fc03、 AVFluscFv/Fc04、AVFluscFv/Fc05)與安徽株禽流感病毒 (A/Anhui/1/2005)及其重組 HA免疫熒光均為陽性,與甲1型人流感病毒A/Hubeihs/53/2005(H1N1)及甲3型人流感病毒 A/Yunnan/1145/2005(H3N2)免疫熒光均為陰性,如圖3所示AVFluscFv/Fc01免疫熒光結果,其余4株抗體免疫熒光結果與AVFluscFv/Fc01相同。免疫熒光結果證明從抗體庫篩選獲得的陽性克隆均針對 H5N1禽流感病毒血凝素蛋白 HA,而與甲1型和甲3型人流感病毒無交叉反應的人源單抗。

圖4 抗禽流感病毒 H5N1人源scFv-Fc抗體與禽流感病毒 H5N1及其重組 HA以及流感病毒 H1N1、H3N2的免疫熒光反應Fig.4 Immunofluorescence assay analysis of human scFv-Fc antibody binding activities to H5N1,H1N1 and H3N2 viruses and the recombinant expressed HA of the H5N1 virus

3 討 論

本研究采用噬菌體表面展示技術,以 H5N1禽流感病毒安徽株HA為抗原,從人源大容量天然抗體庫中篩選抗 HA的基因工程抗體。篩選中所投入抗體庫為人源大容量天然抗體庫,其構建參見文獻[8],該抗體庫來源于44個健康人淋巴細胞,容量為5×109,抗體庫利用高效噬菌體 Hyperphage包裝[9],大大提高了重組抗體在噬菌體表面展示的效率,進而提高了后續陽性克隆的篩選效率。本研究獲得的82株特異性結合 H5N1禽流感病毒 HA的人源 scFv單克隆抗體中,分別屬于 5個不同的抗體序列,即共發現5株帶有不同的抗體輕重鏈可變區序列及其組合的抗體,其重鏈可變區分類在 IgG VH1和 VH3家族,其輕鏈可變區分類在 IgG VL1和VL6家族。

抗體在體內的作用是一個綜合作用,一方面是通過和病毒的結合阻礙病毒的傳播,另一方面,Fc段是抗體分子發揮功能的重要元件,包括抗體介導的細胞毒性作用和補體介導的細胞裂解作用。這些作用依靠全抗體分子中的Fc片段的存在,所以我們將5株人源單鏈抗體scFv基因克隆入攜帶人源Fc段的表達載體,實現scFv-Fc融合抗體的分泌型表達,短時間內完善了抗體功能及下游檢測方面的需求。為了證實所獲得的重組scFv-Fc融合抗體對禽流感病毒 H5N1的結合特異性,我們選擇了較為典型 H1、H3、H5三種流感病毒株以及 H5亞型重組表達的血凝素 HA抗原與篩選獲得的人源單抗進行免疫熒光檢測,結果顯示從抗體庫篩選獲得的5株人源單抗與禽流感病毒 H5N1及其 HA具有較好的特異性,而與甲1型和甲3型人流感病毒無交叉反應。

天然大容量抗體庫,是一種不經過免疫就能獲得針對某種抗原的基因工程抗體的技術[1],可以分離到針對自身抗原、無免疫原性或毒性抗原的抗體;抗體產生時間短,在庫容量足夠大的時候可以獲得高親和力抗體。本研究從人源大容量天然抗體庫中利用高通量的篩選策略在短時間內成功獲得了抗禽流感病毒 H5N1人源單抗,因此非免疫抗體庫尤其是天然抗體庫成為快速獲得突發新發傳染病治療或診斷用抗體的應急儲備庫。目前我們已經獲得了抗H5N1禽流感病毒scFv基因所對應的全抗體基因,體外的中和試驗及其 HA抗原表位方面的鑒定也在進行當中。

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