福建省非典型腸致病性大腸桿菌(aEPEC)的發(fā)現(xiàn)及某些分子特征的研究

陳愛平,陳建輝,楊勁松,林 杰,鄭金鳳,嚴(yán)延生

在所有能夠引起人類發(fā)病的大腸桿菌中,腸致病性大腸桿菌(enteropathogenicEscherichia coli,EPEC)通常被認(rèn)為主要引起發(fā)展中國家嬰幼兒腹瀉[1]。在1995年巴西圣保羅召開的第二屆國際EPEC大會上[2],與會者對 EPEC定義達(dá)成共識,“EPEC為致瀉性大腸桿菌,在小腸細(xì)胞產(chǎn)生特有的粘附和脫落(A/E)組織病理損傷,不產(chǎn)生志賀、志賀樣或vero毒素”?；贓PEC攜帶的毒力基因的不同,將 EPEC分為典型的致病性大腸桿菌(tEPEC)和非典型的致病性大腸桿菌(aEPEC),tEPEC菌株含有緊密素(intimin)eaeA和束狀菌毛bf p基因,而aEPEC菌株只含有eaeA基因。eaeA位于腸細(xì)胞脫落位點(L EE)毒力島上,病原菌所致A/E損傷的所必需基因都位于L EE毒力島上,bf p基因位于 EPEC粘附因子質(zhì)粒(EAF)上,因此 tEPEC和aEPEC菌株是有共同L EE毒力島的不同生物體[3-4],同時人是tEPEC唯一的宿主,aEPEC卻是人和動物都可以成為宿主[5],aEPEC被認(rèn)為是一種新發(fā)的傳染病病原[3]。

aEPEC菌株作為新出現(xiàn)腸道致病菌,世界各地均有檢出。aEPEC菌株與工業(yè)發(fā)達(dá)國家腹瀉爆發(fā)有關(guān)(成人和兒童),也見于發(fā)展中國家和發(fā)達(dá)國家散發(fā)腹瀉病例。目前,多個國家發(fā)現(xiàn)aEPEC發(fā)病率高于tEPEC[6-10]。在一些發(fā)展中國家如巴西、印度、墨西哥的調(diào)查數(shù)據(jù)表明,腹瀉病例中aEPEC比例相對高于tEPEC[3,11-12]。國內(nèi)關(guān)于aEPEC鮮有報道,更缺乏該病原菌流行狀況的本底資料。

2010年10月我們從一死嬰病例的糞便中分離鑒定出非典型腸致病性大腸桿菌(aEPEC),且是培養(yǎng)分離優(yōu)勢生長菌,這是福建省首次發(fā)現(xiàn)該病原,本研究的目的是了解該病原菌的菌株特征,為進(jìn)一步開展aEPEC的研究工作提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例描述 該病例死亡前1～2 d無排便、進(jìn)食差、腹脹明顯、叩診腹部鼓音。臨終前4～5 h呻吟、肚子脹明顯,死亡前1 h腹瀉1次,呈蛋花樣,無嘔吐。

1.2 標(biāo)本的常規(guī)分離培養(yǎng) 將保存在生理鹽水為介質(zhì)的肛拭原液直接劃線接種于麥康凱平板(編號為2010137M-S1)和 SS平板(編號為 2010137SS1),37℃培養(yǎng)過夜。另外肛拭標(biāo)本用沙門菌選擇性亞硒酸鹽亮綠磺胺增菌液(SBG)過夜增菌后,劃線接種于SS平板,37℃培養(yǎng)過夜。

1.3 生化鑒定 采用梅里埃公司生產(chǎn)的API 20E生化鑒定條以及廣東環(huán)凱微生物科技技術(shù)有限公司生產(chǎn)的微量生化鑒定管。

1.4 血清學(xué)診斷 采用玻片凝集,診斷血清的生產(chǎn)廠家為寧波天潤,在有效期內(nèi)使用。

1.5 藥敏試驗 采用 K-B法。

1.6 實時熒光PCR(RT-PCR) 五類致瀉性大腸桿菌(ETEC EPEC EHEC EIEC EAEC)的實時熒光診斷試劑盒及其它的13種常見食源性致病菌診斷試劑盒購自上海之江生物科技有限公司,模板DNA的提取及實時熒光PCR的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序按照試劑盒使用說明書。本文中所用的引物序列依據(jù)相應(yīng)文獻(xiàn)描述,引物資料見表1,寡核苷酸由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。常規(guī)PCR反應(yīng)均采用20μL的反應(yīng)體系,除了特殊說明,各組成成分的終濃度分別為:Ex Taq DNA聚合酶 0.5 U,dNTP 200μmol/L ,上游引物 0.4 μmol/L,下游引物 0.4μmol/L,DNA 模板 2μL。常規(guī)PCR擴(kuò)增程序:預(yù)變性 94℃5min,94℃30 s 55℃30 s 72℃30 s,循環(huán)25次;補(bǔ)平 72℃5 min。

1.7 模板的制備 直接吸取肛拭原液(保存介質(zhì)為生理鹽水)500μL,100℃煮沸裂解10min,13 000r/min離心5min,取上清做為實時熒光 PCR檢測的DNA模板(編碼為DNA-S1)。分純的細(xì)菌,直接刮取適量的細(xì)菌于 300μL的純水制備成菌懸液,100℃煮沸裂解10min,13 000r/min離心5min,取上清做為實時熒光PCR及常規(guī)PCR檢測的DNA模板。

表1 基因及引物序列表Table 1 G enes and primer sequences in this study

1.8 試劑儀器 Ex Taq DNA聚合酶、dN TP購自大連寶生物工程有限公司,瓊脂糖為BioAsia分裝品,電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-6C型,讀膠儀為上海培清生產(chǎn)的JS-380,PCR擴(kuò)增儀為GStorm(GeneTech),實時熒光 PCR儀為Rotor-gene 6000(Corbett)。

1.9 DNA序列的測定及比較 序列測定由上海生工完成,248bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序后用DNAStar分析軟件進(jìn)行拼接,校正后的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行核苷酸的Blast比較。

2 結(jié) 果

2.1 從肛拭原液直接提取的DNA標(biāo)本(DNAS1),實時熒光 PCR(RT-PCR)檢測病原菌基因的結(jié)果。

2.1.1 實時熒光檢測標(biāo)本DNA-S1五類致瀉性大腸桿菌基因,結(jié)果為 EPEC-A(+)、EPEC-B(-),EHEC-stx1(-)、EHEC-stx2(-),ETEC-ST(-)、ETEC-L T(-),EIEC(-),EAEC(-)。

2.1.2 DNA-S1標(biāo)本其它常見的13種食源性致病菌(包括霍亂弧菌、傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌、沙門菌、志賀菌、副溶血弧菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸耶爾森氏菌、創(chuàng)傷弧菌、溶澡弧菌、單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、O157∶H7)的相關(guān)基因RT-PCR檢測均為陰性。本研究所有實時熒光及常規(guī)PCR的實驗每個基因均設(shè)有陽性對照和陰性對照,陽性對照的結(jié)果均呈陽性,陰性對照的結(jié)果均呈陰性。

2.1.3 標(biāo)本DNA-S1的RT-PCR病原菌基因檢測結(jié)果表明 該標(biāo)本中存在有 EPEC-A基因,而EPEC-B基因為陰性,根據(jù)試劑盒提供的判斷標(biāo)準(zhǔn),提示為不典型的腸致病性大腸桿菌(aEPEC)核酸檢測陽性。

2.2 標(biāo)本的常規(guī)分離培養(yǎng) 將保存在生理鹽水為介質(zhì)的肛拭原液直接劃線接種于麥康凱平板和SS平板,過夜培養(yǎng)后平板上細(xì)菌生長情況如下:

2.2.1 麥康凱平板(編號為2010137M-S1)上有兩種菌落,一為中等大、半透濁、圓形濕潤呈優(yōu)勢生長,編號為2010137M①;另一種為較大、紅心半透、圓形濕潤菌落(后一種菌落依據(jù)菌落特征、克氏雙糖鐵、賴氨酸動力及血清凝集實驗后排除掉腸道致病菌)。

2.2.2 SS平板(編號為2010137S-S1)上生長有兩種菌落,一為中等大、半透、圓形濕潤呈優(yōu)勢生長,編號為2010137S①;另一種為較大、紅心邊半透、圓形濕潤菌落(后一種依據(jù)菌落特征、克氏雙糖鐵、賴氨酸動力及血清凝集實驗后排除掉腸道致病菌)。

2.3 分純菌株2010137M①和2010137S①的綜合檢測結(jié)果

2.3.1 生化鑒定 API 20E生化鑒定條鑒定結(jié)果為大腸埃希氏菌,同時用微量生化管手工鑒定也符合大腸埃希氏菌生化特征。具體生化反應(yīng)特征為:葡萄糖⊕、乳糖+、麥芽糖+、甘露醇+、蔗糖-、靛基質(zhì) + 、甲基紅+ 、VP-、枸椽酸鹽-、尿素-、苯丙氨酸-、丙二酸鹽鈉-、水楊素-、氧化酶-、硝酸鹽還原+、阿拉伯糖+、衛(wèi)矛醇-、肌醇-、鼠李糖+、蕈糖+、木糖+、山梨醇+、鳥氨酸脫羧酶-、精氨酸雙水解酶-、賴氨酸脫羧酶+、硫化氫-、ONPG+、氰化鉀-。

2.3.2 血清學(xué)診斷 現(xiàn)有的典型的EPEC三種多價血清型均不凝集。

2.3.3 藥敏試驗結(jié)果 菌株只對四環(huán)素耐藥、氨芐西林呈中度敏感,對于其它的實驗藥物均為敏感,包括頭孢類藥物(頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢噻吩),喹諾酮類(環(huán)丙沙星、萘啶酸),氨基糖甙類(慶大霉素、鏈霉素),磺胺類(磺胺、甲氧芐啶、復(fù)方新諾明),阿莫西林+棒酸和氯霉素。

2.3.4 分子生物學(xué)檢測結(jié)果 運(yùn)用RT-PCR檢測2010137M①和 2010137S①分純細(xì)菌 DNA的EPEC基因,結(jié)果均為 EPEC-A(+)、EPEC-B(-),提示菌株為不典型的腸致病性大腸桿菌(aEPEC)。同時運(yùn)用 RT-PCR檢測 EHEC基因,結(jié)果均為EHEC-stx1(-)、EHEC-stx2(-)。進(jìn)一步運(yùn)用常規(guī)PCR檢測 EPEC的eaeA和bf p基因,結(jié)果為eaeA(+)、bf p(-),符合aEPEC菌株的診斷標(biāo)準(zhǔn),同時檢測可能相關(guān)的毒力因子paa和ehxA,均為陰性。

2.3.5eaeA基因的序列測定及結(jié)果分析 248bp的eaeA序列在NCBI上 GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中比對的結(jié)果均提示為大腸埃希氏菌(EHEC/EPEC)緊密素(intimin)的eaeA基因。

2.3.6 綜合以上實驗結(jié)果 2010137M①和2010137S①菌株判定為不典型的腸致病性大腸桿菌(aEPEC)。肛拭原液直接劃線接種于麥康凱平板和SS平板上aEPEC均呈優(yōu)勢生長,說明在病例的糞便標(biāo)本中該病原菌的數(shù)量是占優(yōu)勢的。

2.4 肛拭標(biāo)本另用沙門菌選擇性增菌液亞硒酸鹽亮綠磺胺增菌液(SBG)過夜增菌后,劃線接種于SS平板,從該平板上生長的菌落中檢出鼠傷寒沙門菌。直接肛拭原液提取的DNA標(biāo)本DNA-S1 RT-PCR檢測沙門菌基因為陰性,同時肛拭原液直接接種于SS平板也沒有檢出鼠傷寒沙門菌,原因是該病原菌的數(shù)量比較少在使用方法的檢測限制下,經(jīng)SBG選擇性增菌后,鼠傷寒沙門菌在SS平板上呈非優(yōu)勢生長。結(jié)果表明該病例存在細(xì)菌混合感染,但是否是由于細(xì)菌感染導(dǎo)致病例的死亡,需要病理解剖的結(jié)論。

3 討 論

我們從1例8月齡的死嬰糞便標(biāo)本中分離到(aEPEC),為福建省首次從患者標(biāo)本中檢出這類菌株。

aEPEC和tEPEC的區(qū)別主要是在于都有eaeA基因,但是aEPEC缺少bf p基因。實時熒光 PCR結(jié)果提示:在肛拭子標(biāo)本直接提取的核酸中存在非典型的腸致病性大腸桿菌核酸片段,對常規(guī)培養(yǎng)在麥康凱平板和SS平板上優(yōu)勢生長的菌落,運(yùn)用實時熒光PCR鑒定出該病原菌為aEPEC。為了進(jìn)一步證實該結(jié)果,我們運(yùn)用常規(guī)PCR擴(kuò)增分純細(xì)菌的eaeA和bf p基因,結(jié)果也吻合aEPEC的病原菌特征,即eaeA基因陽性、bf p基因陰性。同時結(jié)合該病原菌生化鑒定的結(jié)果符合大腸埃希氏菌特征,現(xiàn)有的典型的EPEC血清群都不能凝聚,鑒定該病原菌為aEPEC(未分型)。這與國際上報道的目前大部分的aEPEC血清不能歸于現(xiàn)有典型的 EPEC血清群的結(jié)果也是相吻合的[16]。eaeA序列測定后比對的結(jié)果也提示該基因是大腸埃希氏菌(EHEC/EPEC)緊密素(intimin)的eaeA基因。

在遺傳關(guān)系上,aEPEC和腸出血性大腸桿菌(EHEC或STEC)更為密切,但是不含有類志賀毒素stx1和stx2。我們運(yùn)用實時熒光PCR對該病原菌檢測stx1和stx2基因的結(jié)果也均為陰性。關(guān)于aEPEC毒力的研究主要是基于 EHEC的毒力相關(guān)基因以及其它致瀉性大腸埃希氏菌(DEC)相關(guān)毒力基因的鑒定。Afset等[7]在調(diào)查挪威腹瀉病小孩中分離到的aEPEC菌株中發(fā)現(xiàn)屬于 EHEC毒力島OI-122(ef a1/lif A、nleB、nleE和sen)基因,及屬于 EHEC菌株O113血清群的lpfA基因特別常見;其它的基因如豬A/E相關(guān)基因paa和 EHEC的溶血基因ehxA,也發(fā)現(xiàn)和aEPEC的腹瀉病相關(guān)[15]。我們檢測了paa和ehxA基因,發(fā)現(xiàn)我們分離的菌株均為陰性。Trabulsi等研究表明通常aEPEC菌株比tEPEC更有可能攜帶來自其它DEC的毒力編碼基因[3]。Vieira、Gomes等證實不能劃歸于典型的EPEC血清群的aEPEC,其毒力基因的重組方式及來源形式更具多樣性[17-18]。因為致瀉性大腸桿菌編碼毒力因子的基因可以是位于可以轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒、PAIs(毒力島)、轉(zhuǎn)座子及細(xì)菌的噬菌體上,不同的毒力基因重組在aEPEC菌株中的發(fā)現(xiàn)不是什么奇怪的事,這些基因序列可以通過腸道內(nèi)和(或)外環(huán)境進(jìn)行水平的傳遞。另外,有些菌株可能是tEPEC丟失了 EAF質(zhì)粒或者部分質(zhì)粒,或者 EHEC在感染過程中丟失了stx噬菌體序列,aEPEC也可能是人特異A/E大腸桿菌部分獨(dú)特的亞型;再或者是人感染了家養(yǎng)動物(牛、兔等)中缺失EAF質(zhì)粒的EPEC菌株[5,16,19]。基于以上的情況,我們需要進(jìn)一步檢測其它毒力相關(guān)基因,并深入探討這些基因和菌株致病力的關(guān)系。

關(guān)于aEPEC的研究報道國內(nèi)比較少,我們擬進(jìn)一步調(diào)查在腹瀉病人及動物宿主中該病原菌的攜帶情況,分離更多類似菌株后進(jìn)行分子流行病學(xué)、序列測定等研究,分析菌株間的遺傳相似度、標(biāo)志毒力基因等分子特征,為aEPEC的防治提供一些基礎(chǔ)的本底資料。

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