珍菊降壓片中西藥物配伍對高血壓相關基因表達的影響﹡

朱國琴 張 聰 蔡國琴 王建新

1.復旦大學藥學院，上海 201203；2.上海市中藥研究所，上海 201401

珍菊降壓片系中西藥物復方降壓制劑，由野菊花浸膏、珍珠層粉及蘆丁三味中藥（或提取物）和氫氯噻嗪與鹽酸可樂定兩味西藥成分組成，是臨床上治療輕中度原發性高血壓的常用藥物之一[1]。高血壓病作為臨床上的常見病、多發病，長期服用有效的降壓藥，仍是目前防治的主要措施之一。雖然目前臨床上用于抗高血壓的藥物較多，化學藥物雖然起效較快，但普遍存在較大的副作用；中藥藥性較為溫和，但相對來說起效較慢，效果不夠顯著。珍菊降壓片就是在將中西藥物的特點結合起來的思路指導下研制而成的，諸多臨床試驗也證實了其組方的合理性，無論是單獨作為降壓藥，還是與其他藥物聯合應用，都表現出了良好的效果。方中用野菊花清熱降火、清利頭目、平肝降壓；珍珠層粉平肝潛陽、安神定驚、清熱明目，共為主藥。鹽酸可樂寧具有中樞降壓作用，氫氯噻嗪為利尿降壓藥，共為輔藥。蘆丁降低毛細血管通透性，增加其張力為佐使藥，諸藥合用共奏平肝、潛陽、清熱、降壓之功。黃琳紅等[2]進行的腎性高血壓大鼠實驗顯示，珍菊降壓片有良好的抗高血壓作用，且未出現西藥組分引起的停藥后血壓反跳現象，對血脂和血脂蛋白無顯著性影響，說明中藥組分對抗了西藥組分的不良反應。但目前關于珍菊降壓片等中西復方制劑的中西藥物配伍應用作用機制研究報道很少[3]，本研究采用血清藥理學的方法，通過拆方研究，探討珍菊降壓片中西藥物配伍后對高血壓相關基因表達的影響，探討其配伍機理。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 ICR小鼠（SHR）80只，雌雄各半，體重18～20 g，購自中英合資上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號：SYXK（滬）2003-0029。

1.1.2 受試藥物 珍菊降壓片原料藥（簡稱：復方，下同），土褐色粉末，由上海雷允上藥業有限公司提供，將野菊花膏粉、珍珠層粉、蘆丁、氫氯噻嗪、鹽酸可樂定按100∶100∶20∶5∶0.03比例混勻，然后用0.5%CMC蒸餾水液調配成1.4%的藥液，備用。

1.1.3 對照藥物 對照藥物1∶珍菊降壓片中藥部分（簡稱∶中藥，下同），土褐色粉末，由上海雷允上藥業有限公司提供，將野菊花膏粉、珍珠層粉、蘆丁按100∶100∶20比例混勻，然后用0.5%CMC蒸餾水液調配成1.37%的藥液，備用。對照藥物2：珍菊降壓片西藥部分（簡稱：西藥，下同）白色粉末，由上海雷允上藥業有限公司提供，將氫氯噻嗪、鹽酸可樂定按500：3比例混勻，然后用0.5%CMC蒸餾水液調配成0.03%的藥液，備用。

1.1.4 細胞株 人臍靜脈內皮細胞株ECV-304，來源于復旦大學遺傳工程國家重點實驗室。

1.1.5 試劑 流式細胞儀檢測用試劑：碘化丙碇（鼎國），triton-X100（生工）芯片檢測用試劑：GeneChip Expression 3’Amolication One-Cycle Target Labeling and Control Reagents（Affymetrix）；RNeasy Mini Kit（50）（QIAGEN）；Trizol（Invitrogen）；DEPC-water（Ambion）；Herring Sperm DNA（Promega）；BSA（Inventrgen）；MOPS（Sagon）；β-Mercaptoethanol（Sagon）；Normal Goat IgG（Sigma）；Biotinylated Antibody（VectorLabs）；MEA Free Acid Monohydrate SigmaUltra（Sigma-Aldrich）；MES sodium salt（Sigma-Aldrich）；10%Tween-20（Pierce）；SSPE（Cambrex）；R-Phycoerythrin Streptavidin（Invitrogen）；DMSO（Sigma）

1.1.6 基因芯片 Human Genome Y133 Plus 2.0（Affymetrix）。

1.1.7 檢測儀器 高速離心機（LABOFUGE400R型）；電子天平（AL204型，Metter Toledo）；熒光倒置顯微鏡（XDS-1B，重慶光電儀器廠）；流式細胞儀（FCESCalibur型，B&D）；GeneChip System（Affymetrix）。

1.2 實驗方法

將ICR小鼠按體重分為4組，每組20只，設復方組，復方組分中相應劑量中藥組、西藥組，空白對照組。復方、中藥、西藥三組分別灌胃給予復方280 mg/kg、中藥274 mg/kg、西藥6.2 mg/kg，空白對照組灌胃給同體積0.5%CMC蒸餾水液20 mL/kg，每日1次，連續7 d。末次給藥后2 h，小鼠眼眶動脈處取血，血液凝固、收縮后，4℃狀態下離心，分離含藥血清，備用。

選取生長狀況最好的ECV-304人臍靜脈內皮細胞1傳4，24 h后，將中藥、西藥、復方及對照組動物血清過濾，分別取250μL血清加入至含10%胎牛血清的5 mL培養基中，使其終濃度為5%，于37℃孵育箱培養，24 h后觀察細胞表型，用熒光倒置顯微鏡拍攝細胞形態，流式細胞儀檢測細胞周期，并抽提ECV-304細胞RNA，反轉錄，Cy3標記和Cy5標記，送樣作Affimatrix表達譜芯片分析。

2 實驗結果

2.1 細胞表型變化

熒光倒置顯微鏡下觀測可見，ECV-304細胞經含藥血清培養基培養，其形態與生長密度無明顯改變，但各組細胞內的顆粒物有所增加，說明珍菊降壓片在動物體內代謝后釋放入血清的物質會影響細胞表型，但無明顯毒性。細胞的熒光照片見圖1。

圖1 添加不同小鼠血清培養基培養的細胞形態

2.2 細胞周期變化

細胞的周期間期是以DNA合成為標志，可分為G1期，S期和G2期。G1期是指DNA合成前期，主要進行細胞體積的增大，并為DNA合成作準備，S期主要是指細胞DNA合成期，染色體數目在此期加倍，G2期為DNA合成后至細胞分裂開始之前的第二個間期，為細胞分裂作準備。S期是細胞能否增殖的重要階段。

流式細胞儀檢測可見，與空白對照組相比，加入含藥血清后中藥組、西藥組G1期細胞百分比均顯著下降（P＜0.05），S期細胞百分比均顯著增加（P＜0.05），復方組G2期細胞百分比顯著下降、S期細胞百分比顯著增加（P＜0.05），顯示中藥、西藥或復方中的成分可促進細胞增殖。結果見表1、圖2。

表1 含藥血清對細胞周期變化及細胞凋亡的影響（±s，n=20）

表1 含藥血清對細胞周期變化及細胞凋亡的影響（±s，n=20）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

血清類型 不同周期細胞率（%）G1 G2 S空白對照組 52.24±1.95 7.87±1.90 39.90±0.41中藥組 43.18±1.60** 8.73±0.40 48.09±1.37**西藥組 44.66±3.57* 8.71±2.20 46.62±1.39**復方組 46.80±3.57 4.44±0.60* 48.76±2.24**

圖2 含藥血清處理24 h后處于不同周期的細胞百分比

2.3 基因表達變化

ECV-304細胞經含藥血清培養基培養后，有多組基因出現表達顯著上調或下調。其中，中藥組基因顯著變化（上調或下調）有63條，西藥組94條，復方組186條。而可能與高血壓相關的候選基因顯著變化者，中藥組有18條，西藥組30條、復方組51條。

中藥含藥血清作用于細胞后表達顯著上調的可能與高血壓相關的侯選基因有13條，分別為血管活性多肽及其受體（SMO、KLK13、AGTR1），生長因子、細胞因子及受體（CCBP2、IL8、PTX3），鹽敏感基因、轉運蛋白及離子通道（ATP7B），細胞增殖、凋亡相關基因（RRP22、RASSF3），轉錄因子、發育相關分子（PROSC、ELL2、PBX2），細胞信息傳遞分子（NTRK3）。中藥含藥血清作用細胞后表達顯著下調的可能與高血壓相關的侯選基因5條，分別為細胞增殖、凋亡相關基因（DAP3），應激分子及細胞外基質（COL8A1），轉錄因子、發育相關分子（MIER3），脂代謝分子（DPP6），黏附分子及受體（AKAP10）。

西藥含藥血清作用細胞后表達顯著上調的可能與高血壓相關的侯選基因16條，分別為生長因子、細胞因子及受體（ECGF1、CCL16、CXCL2、CCL20、IL8、PTX3），細胞增殖、凋亡相關基因（ANKRD30A、CDCA7、CCAR1、DIDO1），應激分子及細胞外基質（CRHR1），轉錄因子、發育相關分子（TRERF1、NFX1、HDAC6），細胞信息傳遞分子（ERN1），脂代謝分子（IDH1）。西藥含藥血清作用細胞后表達顯著下調的可能與高血壓相關的侯選基因14條，分別為血管活性多肽及其受體（EDG2），生長因子、細胞因子及受體（RPS6KA6），鹽敏感基因、轉運蛋白及離子通道（ATP1A4、GNPTAB），細胞增殖、凋亡相關基因（CCNG2），應激分子及細胞外基質（COL8A1），轉錄因子、發育相關分子（ATF7、MESDC2、GATS、MIER3），細胞信息傳遞分子（SLC7A3、ADRA1A），脂代謝分子（DPP6），黏附分子及受體（PCDH9）。

復方含藥血清作用細胞后表達顯著上調的可能與高血壓相關的侯選基因46條，分別為血管活性多肽及其受體（SMO、KLK13、AGTR1），生長因子、細胞因子及受體（CCBP2、IL8、PTX3、TGFBR1、IRAK1BP1、FGF22、GABRQ、ECGF1、CCL20、CXCL1、GNB2L1、GPR125、CXCL2、CRIM1、CXCL6、FOLR1、SSR4、EGFR），鹽敏感基因、轉運蛋白及離子通道（ATP7B、GLYATL1、ATPVOA1、PITPNB、SLC25A37），細胞增殖、凋亡相關基因（RSU1、PDCD5、BLRC3），轉錄因子、發育相關分子（HDAC9、TFAP2B、PBX1、CRSP8、TAFIC、SFRS5、NFX1、SFRS4、TFCP2），細胞信息傳遞分子（NTRK3、ARHGDIB），脂代謝分子（IDH1、ZAP70、ELOVL5、PRKAA1、IMMT），粘附分子及受體（ITGB3）。復方含藥血清作用細胞后表達顯著下調的可能與高血壓相關的侯選基因5條，分別為生長因子、細胞因子及受體（HSD3B1），鹽敏感基因、轉運蛋白及離子通道（LARGE），轉錄因子、發育相關分子（MIER3），細胞信息傳遞分子（RUNX1，CPEB2）。

經對比分析，可能與高血壓相關的侯選基因中，中藥組和復方組共同表現顯著上調的基因8條，分別為血管活性多肽及其受體（SMO、KLK13、AGTR1），生長因子、細胞因子及受體（CCBP2、IL8、PTX3），鹽敏感基因、轉運蛋白及離子通道（ATP7B），細胞信息傳遞分子（NTRK3），共同表現顯著下調的基因1條，為發育相關分子（MIER3）；西藥組和復方組共同表現顯著上調的基因7條，分別為生長因子、細胞因子及受體（ECGF1、CXCL2、CCL20、IL8、PTX3），轉錄因子、發育相關分子（NFX1），脂代謝分子（IDH1），共同表現顯著下調的基因1條，為發育相關分子（MIER3）；中藥組、西藥組和復方組共同表現顯著上調的基因2條，為生長因子、細胞因子及受體（PTX3、IL8），共同表現顯著下調的基因1條，為發育相關分子（MIER3）。

3 討論

珍菊降壓片及其組方中中藥和西藥部分以2.8倍臨床使用劑量連續7 d口服給藥，其小鼠血清對ECV-304細胞無明顯毒性作用，但可促進其增殖。從基因表達變化可見，中藥組、西藥組及復方組表現出多靶點的作用特點。中藥組、西藥組、復方組有著相同的和不同的基因表達變化，其中有一些可能與高血壓發生發展的各種因素密切相關，包括與脂代謝、血管活性多肽及其受體、鹽敏感基因、轉運蛋白及離子通道、生長因子、細胞因子及受體、細胞信息傳遞分子等相關的基因表達變化，從中顯示了其治療高血壓的活性靶點及作用機理。復方組表現出不同于中藥組、西藥組的作用靶點，復方組上調基因個數大于中藥組、西藥組各自上調基因之和，復方組下調基因個數小于中藥組、西藥組分別下調基因之和，提示處方中中西藥物配伍后發揮出不同于單獨使用中藥、西藥的作用。

本研究對珍菊降壓片中西藥物配伍后對ECV-304人臍靜脈內皮細胞可能與高血壓相關的候選基因的表達變化作了初探，隨著高血壓相關基因研究的不斷深入，將對珍菊降壓片中西藥配伍后對高血壓相關基因的表達進行進一步更深入地研究。

[1] 吳躍進，黃湘.中西藥復方降壓藥珍菊降壓片的研究與應用概況[J].中國中醫基礎醫學雜志，2005，11（3）：238-241.

[2] 黃琳紅，袁秉祥，賀建宇，等.珍菊降壓片對腎性高血壓大鼠血壓的影響[J].西安交通大學學報（醫學版），2003，24（6）：615-617.

[3] 左錚云，盧毓雄，呂愛平.應加強中西藥配伍的基礎研究[J].中國中醫基礎醫學雜志，2005，11（11）：861-862.