西羅莫司對(duì)減輕小口徑移植血管材料內(nèi)膜增生的作用

馬曉華 ，王學(xué)寧 ，張順業(yè) ，張 勇 ，郭曉亮 ，高 進(jìn) ，李天亮

1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001；2.山西省心血管病醫(yī)院，山西太原 030001

西羅莫司對(duì)減輕小口徑移植血管材料內(nèi)膜增生的作用

馬曉華1，王學(xué)寧2，張順業(yè)2，張 勇2，郭曉亮1，高 進(jìn)1，李天亮2

1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001；2.山西省心血管病醫(yī)院，山西太原 030001

目的：將脫細(xì)胞聯(lián)合肝素處理的小口徑異種移植血管進(jìn)一步結(jié)合西羅莫司，以觀察術(shù)后移植血管內(nèi)膜增生的情況。方法：將脫細(xì)胞聯(lián)合肝素處理的犬頸動(dòng)脈進(jìn)一步結(jié)合西羅莫司，并分為A組（對(duì)照組，脫細(xì)胞并結(jié)合肝素）和B組（西羅莫司組，脫細(xì)胞并結(jié)合肝素+西羅莫司處理）兩組。取健康家兔16只，隨機(jī)分為兩組（每組8只），利用兔頸動(dòng)脈旁路移植模型，分別移植A組和B組的血管進(jìn)行比較。術(shù)后分別于1、2、4、8周采血采用HPLC法檢測(cè)B組移植血管中西羅莫司的含量。術(shù)后3個(gè)月超聲檢測(cè)移植血管通暢情況，并取血管樣本經(jīng)免疫組織化學(xué)和HE染色觀察內(nèi)膜增生程度。結(jié)果：B組8周后仍可檢測(cè)到西羅莫司，且含量呈逐漸降低趨勢(shì)。術(shù)后3個(gè)月超聲顯示，A組部分血管（2/8）斑塊形成、管腔狹窄，B組血管無(wú)明顯狹窄（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示，A、B兩組血管管壁均可見(jiàn)新生的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。HE染色提示，B組內(nèi)膜增生程度較A組輕[A、B兩組內(nèi)膜/中膜厚度比分別為（1.63±0.04）μm、（0.43±0.04）μm]（P＜0.05）。結(jié)論：在脫細(xì)胞結(jié)合肝素的小口徑異種移植血管上進(jìn)一步結(jié)合西羅莫司可以有效減輕內(nèi)膜增生。

西羅莫司；內(nèi)膜增生；血管移植；小口徑

小口徑血管移植常因血栓形成、內(nèi)膜增生等原因?qū)е乱浦惭馨l(fā)生狹窄、閉塞。本實(shí)驗(yàn)的前期研究中，將犬頸動(dòng)脈脫細(xì)胞結(jié)合肝素處理構(gòu)建出小口徑異種血管材料，并移植入兔頸動(dòng)脈，術(shù)后6個(gè)月的觀察發(fā)現(xiàn)移植血管均無(wú)阻塞，通暢性較好，但部分血管內(nèi)發(fā)現(xiàn)不同程度的內(nèi)膜增生，導(dǎo)致管腔狹窄[1]。西羅莫司抑制血管內(nèi)膜增生的作用已經(jīng)在冠狀動(dòng)脈藥物涂層支架及人工血管得到證實(shí)和廣泛應(yīng)用[2-3]，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，將脫細(xì)胞聯(lián)合肝素處理的犬頸動(dòng)脈進(jìn)一步結(jié)合西羅莫司，以觀察其抑制血管內(nèi)膜增生和預(yù)防再狹窄的作用。

1 材料與方法

1.1 血管處理

成年犬8只（山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體重15.4～18.2 kg，熱缺血時(shí)間小于5min，取雙側(cè)頸總動(dòng)脈長(zhǎng)約15 cm。小心浸泡于含抗生素（青霉素鉀1 000 U/ml和硫酸鏈霉素1 000μm/ml）的生理鹽水中備用。采用本實(shí)驗(yàn)前期研究應(yīng)用的方法對(duì)取下的犬頸動(dòng)脈進(jìn)行脫細(xì)胞和結(jié)合肝素處理[4-5]。處理后的血管分為兩組：A組（對(duì)照組，脫細(xì)胞并結(jié)合肝素）和B組（西羅莫司組，脫細(xì)胞并結(jié)合肝素+西羅莫司處理）。對(duì)B組血管進(jìn)行結(jié)合西羅莫司處理[6-7]：將聚丙交酯乙交酯（Polylactide coglycotide，PLGA）和西羅莫司物理混和配制成溶液，用浸涂提拉法將血管材料浸入該溶液中，勻速拉出，反復(fù)3次，然后置于室溫下干燥直至溶劑完全揮發(fā)，此條件下使西羅莫司聚合物均勻結(jié)合在血管材料上。

1.2 移植實(shí)驗(yàn)

家兔16只 （由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體重2.2～3.0 kg，雌雄不限，隨機(jī)分為兩組（每組8只）。利用兔頸動(dòng)脈旁路移植模型，分別移植A組和B組的血管進(jìn)行比較。

氯胺酮10mg/kg，地西泮2.5mg/kg，阿托品1.0 mg/kg肌內(nèi)注射麻醉，耳緣靜脈建立輸液通路靜滴鹽酸氯胺酮30μg/（kg·min）維持麻醉。麻醉成功后將家兔仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，取前正中切口，顯露左側(cè)頸總動(dòng)脈，將移植血管分別與犬頸總動(dòng)脈的近心端及遠(yuǎn)心端用8-0 Prolene線做端側(cè)吻合，兩吻合口間距約4 cm，結(jié)扎吻合口之間犬頸總動(dòng)脈，使血流僅通過(guò)移植血管。術(shù)后第1天恢復(fù)常規(guī)飼養(yǎng)，前3 d肌內(nèi)注射青霉素80萬(wàn)U預(yù)防感染并口服小劑量腸溶阿司匹林片。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 西羅莫司的檢測(cè) 應(yīng)用陳宏林等[8]報(bào)道的HPLC法在第1、2、4、8周測(cè)量B組移植血管中西羅莫司的含量。

1.3.2 超聲觀察 術(shù)后3個(gè)月將兩組兔麻醉后用HP Sonos 4500型超聲成像系統(tǒng)（探頭頻率10MHz）檢測(cè)移植血管通暢情況。

1.3.3 HE染色及免疫組織化學(xué)檢測(cè) 術(shù)后3個(gè)月處死動(dòng)物，經(jīng)原切口取移植血管標(biāo)本做如下檢測(cè)。HE染色：標(biāo)本以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，垂直于移植血管長(zhǎng)軸制成5μm切片，進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察內(nèi)膜和中膜厚度及內(nèi)膜/中膜厚度比（I/M），取平均值作為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值。免疫組化染色：采用常規(guī)SP法，以Rabbit Anti-Ⅷ factor、Anti-Beta-Actin作為一抗 （購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司公司），經(jīng)過(guò)脫蠟至水、滅活、抗原修復(fù)、免疫組織化學(xué)染色、復(fù)染、脫水、封片等過(guò)程制成切片，在顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

術(shù)中觀察移植血管彈性好，搏動(dòng)良好，吻合口無(wú)滲血。術(shù)后觀察3個(gè)月，16只兔均成活，無(wú)偏癱，頸動(dòng)脈搏動(dòng)良好。

2.2 西羅莫司濃度檢測(cè)

B組術(shù)后1、2、4、8周均可檢測(cè)到西羅莫司，且含量呈逐漸降低趨勢(shì)（表1）。

2.3 超聲觀察

術(shù)后3個(gè)月發(fā)現(xiàn)部分血管內(nèi)血栓形成，導(dǎo)致管腔狹窄，超聲觀察A組（對(duì)照組）血栓形成率為2/8，B組（西羅莫司組）為 0/8（P＜0.05）。

2.4 HE染色結(jié)果

術(shù)后3個(gè)月觀察發(fā)現(xiàn)，B組內(nèi)膜厚度較A組明顯降低（P＜0.05），B組中膜厚度較A組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B組內(nèi)膜/中膜厚度比顯著低于A組（P＜0.05）（表2）。免疫組織化學(xué)顯示A、B兩組血管可見(jiàn)新生內(nèi)皮細(xì)胞。

表1 HPLC法測(cè)定血管壁中西羅莫司的藥物濃度（±s）Tab.1 The contentof Sirolimus was measured by HPLC(±s)

表1 HPLC法測(cè)定血管壁中西羅莫司的藥物濃度（±s）Tab.1 The contentof Sirolimus was measured by HPLC(±s)

注：與 A 組比較，*P＜0.01

指標(biāo) A組B組（周）1 2 4 8峰面積（mAus）濃度（ng/血管）0 0 350.62 948.55*260.12 800.37*140.52 411.59*22.41 62.85*對(duì)照品83.16 384.00

表2 移植血管內(nèi)膜、中膜厚度及內(nèi)膜增生程度（±s）Tab.2 Intimaland m edial thickness and intimalhyperplasia in the vascular xenograft(±s)

表2 移植血管內(nèi)膜、中膜厚度及內(nèi)膜增生程度（±s）Tab.2 Intimaland m edial thickness and intimalhyperplasia in the vascular xenograft(±s)

注：與 A 組比較，*P＜0.05

組別 血管數(shù)A組B組8 8內(nèi)膜厚度（μ m）8 8±6 2 2±3*中膜厚度（μ m）5 4±5 5 1±3*I/M 1.6 3±0.0 4 0.4 3±0.0 4*

3 討論

冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（CABG）中自體動(dòng)、靜脈是理想的血管替代物，但材料有限，若患者合并大隱靜脈曲張、動(dòng)脈粥樣硬化等都將限制其利用，且患者大多需要3支或3支以上的移植血管，部分還需要2次或2次以上的CABG，自體血管常無(wú)法滿足需要。本課題組的前期實(shí)驗(yàn)[9]將犬頸動(dòng)脈作為小口徑異種血管，采用酶-去污劑法進(jìn)行脫細(xì)胞處理，并結(jié)合肝素，實(shí)驗(yàn)證實(shí)脫細(xì)胞徹底，機(jī)械性能無(wú)明顯破壞；將構(gòu)建的血管材料移植入異種（兔）頸動(dòng)脈，通過(guò)超聲觀察發(fā)現(xiàn)，肝素的結(jié)合處理有助于對(duì)抗血栓形成，提高血管通暢率。

但部分血管內(nèi)由于內(nèi)膜增生使管腔發(fā)生狹窄，可能影響血管的遠(yuǎn)期通暢性，進(jìn)一步減輕內(nèi)膜增生成為本實(shí)驗(yàn)的主要研究方向。西羅莫司洗脫冠狀動(dòng)脈支架已成功應(yīng)用于臨床，大量研究證實(shí)明顯降低了支架置入后再狹窄的發(fā)生率[2，10]；也有研究將西羅莫司與人工血管結(jié)合，動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn)顯示結(jié)合了西羅莫司的人工血管可以有效抑制內(nèi)膜增生[11-13]。本實(shí)驗(yàn)借鑒西羅莫司洗脫支架的方法，使西羅莫司均勻地結(jié)合在血管表面，脫細(xì)胞后的血管材料呈纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，西羅莫司溶液通過(guò)血管纖維孔洞滲透血管壁全層。降解實(shí)驗(yàn)表明PLGA載西羅莫司的降解時(shí)間為3個(gè)月左右[6]。

血管壁平滑肌細(xì)胞的凋亡與增殖是內(nèi)膜增生的重要原因。血管內(nèi)膜增生有三個(gè)高峰：①血管中膜平滑肌細(xì)胞增生；②血管平滑肌細(xì)胞由中膜遷移至內(nèi)膜；③內(nèi)膜顯著增厚[14]。Poon等[15]報(bào)道西羅莫司通過(guò)阻止細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中G1期向S期轉(zhuǎn)變，在體外可抑制人和大鼠的血管平滑肌細(xì)胞的增殖。它與胞質(zhì)受體FK506結(jié)合蛋白FKBP12結(jié)合，特異性作用于哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），使mTOR羧基末端發(fā)生磷酸化反應(yīng)，失去分解活性，阻斷細(xì)胞周期G1期向S期的轉(zhuǎn)變，抑制細(xì)胞增殖和遷移。西羅莫司通過(guò)上述機(jī)制抑制血管內(nèi)膜增生。

本實(shí)驗(yàn)借鑒西羅莫司洗脫冠狀動(dòng)脈支架的原理和技術(shù)，創(chuàng)新性地將西羅莫司結(jié)合到脫細(xì)胞并聯(lián)合肝素處理的犬頸動(dòng)脈上，構(gòu)建新型小口徑異種移植血管材料。在本實(shí)驗(yàn)中，在B組1～8周均可檢測(cè)到西羅莫司，且濃度呈逐漸降低趨勢(shì)，提示西羅莫司在體內(nèi)逐漸釋放，發(fā)揮作用。由免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)A、B兩組內(nèi)均有新生的內(nèi)皮細(xì)胞，且A組內(nèi)膜增生程度大于B組，增生組織主要為新生的血管平滑肌細(xì)胞；由HE染色可見(jiàn)，B組I/M顯著低于A組。由此可見(jiàn)這種新型血管材料充分發(fā)揮了西羅莫司的抗平滑肌增殖與遷移作用及肝素的預(yù)防血栓形成作用，兩種藥物的作用可以相互補(bǔ)充，以達(dá)到抑制內(nèi)膜增生與血栓形成的目的。

在小口徑血管移植中，對(duì)血管材料進(jìn)行脫細(xì)胞結(jié)合肝素、西羅莫司處理后可以減少血栓的形成，降低血管內(nèi)膜增生，提高血管的遠(yuǎn)期通暢性，有可能成為小口徑血管移植材料的新型來(lái)源。

[1]Kang SJ,Park DW,Mintz GS,et al.Long-term vascular changes after drug-elutingstent implantation assessed by serialvolumetric intravascular ultrasound analysis[J].Am JCardiol,2010,105(10):1402-1408.

[2]Walter T,Rey KS,Wendel HP,et al.Thrombogenicity of sirolimuseluting stents and bare metal stents:evaluation in the early phase after stent implantation[J].In Vivo,2010,24(5):635-639.

[3]Schachner T,Zou Y,Oberhuber A,et al.Local application of rapamycin inhibits neointimal hyperplasia in experimental vein grafts[J].Ann Thorac Surg,2005,79(6):2201-2202.

[4]楊岷,陳長(zhǎng)志,成少飛,等.牛心包組織工程心臟瓣膜支架脫細(xì)胞方法的比較[J].中華胸心血管外科雜志,2005,21(6):349-351.

[5]Wang XN,Chen CZ,Yang M,et al.Implantation of decellularized small-caliber vascular xenograftswith and without surface heparin treatment[J].International Center for Artificial Organs and Transplantation,2007,31(2):99-104.

[6]馮博,夏永輝,石強(qiáng),等.國(guó)產(chǎn)雷帕霉素-肝素洗脫支架的制備及其體外實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué)影像雜志,2008,19(2):94-98.

[7]Yosuke Ishii,Shun-ichiro Sakamoto,Russell T.A novel bioengineered small-caliber vascular graft incorporating heparin and sirolimus:excellent 6-month patency[J].Thorac Cardiovasc Surg,2008,135:1237-1246.

[8]陳宏林,尤慶生,孟小勇.HPLC法測(cè)定組織中雷帕霉素的含量[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志,2008,25(7):813-814.

[9]王學(xué)寧,陳長(zhǎng)志,楊岷,等.肝素處理小口徑脫細(xì)胞異種血管的移植研究[J].中華胸心血管外科雜志,2006,22(5):324-325.

[10]Sousa JE,Costa MA,Abizaid A,et al.Four-year angiographic and intravascular ultrasound follow-up of patients treated with sirolimus-eluting stents[J].Circulation,2005,111(18):2326-2329.

[11]Yosuke Ishii,Russell T.Kronengold,novel bioengineered small caliber vascular graftwith excellent one-month patency[J].Ann Thorac Surg,2007,83:517-525.

[12]Lin PH,Bush RL,Yao Q,et al.Evaluation of platelet deposition and neointimal hyperplasia of heparin-coated small-caliber ePTFE grafts in a canine femoral artery bypassmodel[J].Journal of Surgical Research,2004,118(1):45-52.

[13]Conklin BS,Richter ER,Kreutziger KL,etal.Development and evaluation of a novel decellularized vascular xenograft[J].Med Eng Phys,2002,24(3):173-183.

[14]李冠軍,董桂青,金仲品,等.血管內(nèi)膜增生的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)療前沿,2008,3(2):34-36.

[15]Poon M,Marx SO,Gallo R,et al.Rapamycin inhibits vascular smooth muscle cellmigration[J].JClin Invest,1996,98(10):2277-2283.

Effect of Sirolimus on reducing the small diameter of graft intimal hyperp lasia ofmaterials

MAXiaohua1,WANGXuening2,ZHANGShunye2,ZHANGYong2,GUOXiaoliang1,GAOJin1,LITianliang2

1.ShanxiMedical University,Taiyuan 030001,China;2 Shanxi Cardiovascular Hospital,Taiyuan 030001,China

Objective:To observe the effect of intimal hyperplasia,Sirolimuswas integrated in the decellularized and heparinized small-caliber vascular xenograft.Methods:The decellularized and heparinized canine carotid arterieswere further integrated with Sirolimus,and were divided into Group A(Control group,decellularized and heparinized)and Group B(Sirolimus group,decellularized and heparinized+Sirolimus treatment).Sixteen rabbits were randomly divided into two groups (Group A and B,n=8).The grafts of two groups were transplanted respectively into the rabbits,using the rabbit carotid artery bypass graftingmodel.The content of Sirolimus wasmeasured by HPLC at 1,2,4,and 8 week in Group B,respectively.Results:Sirolimus was found in vascular wall of Group B at 8 week after implantation,and the content of Sirolimus declined during the 8 weeks.After 3 months ultrasound showed that plaque formation and vessel stenosis were found in some blood vessels of Group A(2/8),while Group B had no significant vessel stenosis(P＜0.05).Immunohistochemistry showed endothelial cells and smoothmuscle cellswere found in Group A and B.HE stain found that the intimal hyperplasia was lighter in Group B than Group A [thickness ratio of intima tomedia in two groups were (1.63±0.04)μm,(0.43±0.04)μm](P＜0.05).Conclusion:Sirolimus can reduce intimal hyperplasia in the decellularized and heparinized small-caliber vascular xenograft.

Sirolimus;Intimal hyperplasia;Vascular implantation;Small-caliber

R965

A

1673-7210（2011）03（b）-014-03

山西省青年科技研究基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目名稱：冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)中新型橋材料的探索；項(xiàng)目編號(hào)：2009021042-3）。

馬曉華（1983-），男，河北滄州人，畢業(yè)于河北醫(yī)科大學(xué)，醫(yī)學(xué)學(xué)士，山西醫(yī)科大學(xué)2008級(jí)在讀碩士研究生；研究方向：心肌保護(hù)。

王學(xué)寧（1977-），男，山西太原人，畢業(yè)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，博士學(xué)位，主治醫(yī)師。

2010-12-30）