連翹揮發(fā)油的成分分析及抗病毒活性的考察

肖會(huì)敏，何 悅，王四旺，王劍波，謝艷華，繆 珊

第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物研究所，陜西西安 710032

連翹揮發(fā)油的成分分析及抗病毒活性的考察

肖會(huì)敏，何 悅，王四旺，王劍波，謝艷華，繆 珊

第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物研究所，陜西西安 710032

目的：考察連翹揮發(fā)油及其主要成分α-蒎烯及β-蒎烯對甲、乙型流感病毒與乙肝病毒的活性。方法：①通過GC-MS分析翹揮發(fā)油的化學(xué)成分；②以2.2.15細(xì)胞為乙型肝炎病毒載體，分別測定它們抑制乙型肝炎病毒進(jìn)行DNA復(fù)制和產(chǎn)生HBsAg、HBeAg的能力；③以MDCK（狗腎）細(xì)胞為病毒宿主，分別測定它們抑制病毒引起細(xì)胞病變的程度（CPE）。結(jié)果：①在最大無毒劑量時(shí)，即在連翹揮發(fā)油 258.69μg/m l、α-蒎烯 258.69μg/ml、β-蒎烯 192.45μg/ml時(shí)，均無抗乙肝病毒活性；②連翹揮發(fā)油α-蒎烯、β-蒎烯的濃度分別是192.5μg/ml時(shí)，均無抗甲、乙型流感病毒活性；③連翹揮發(fā)油的主要成分是α-蒎烯及β-蒎烯，總相對含量為71.48%。結(jié)論：連翹揮發(fā)油、α-蒎烯及β-蒎烯均無抗甲、乙型流感病毒與乙肝病毒的活性。

連翹揮發(fā)油；α-蒎烯；β-蒎烯；流感病毒；乙肝病毒

連翹為木犀科植物連翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的干燥果實(shí)，其中含有豐富的揮發(fā)油。在連翹心中含量在4%以上，平均可達(dá)3.8%[1]。其揮發(fā)油的主要成分是α-蒎烯、β-蒎烯等[2]。文獻(xiàn)報(bào)道連翹用水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油具有對流感病毒感染小鼠有保護(hù)作用。在雞胚內(nèi)能抑制流感病毒亞甲型、副流感仙臺株的增殖[3]。β-蒎烯具有抑菌、抗感染、抗氧化作用等[4]，α-蒎烯具有抗真菌作用[5-6]。本文旨在分析連翹揮發(fā)油的成分，驗(yàn)證連翹揮發(fā)油的抗流感病毒活性，探討其主要成分即α-蒎烯與β-蒎烯對流感病毒的活性，同時(shí)探討它們對乙肝病毒的活性。

1 材料與儀器

1.1 試劑與試藥

連翹揮發(fā)油，由我所采用水蒸氣蒸餾法提取；α-蒎烯（99%）、β-蒎烯標(biāo)準(zhǔn)品（純度為 99%），由 Sigma-Aldrich 公司提供；陽性對照藥：拉米夫定（3TC），由葛蘭素威康公司生產(chǎn)；乙肝病毒E抗原、S抗原酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所提供；3′-末端DNA探針同位素（α-32P-dCTP）聚合酶標(biāo)記試劑盒，美國Perkin Elmer（PE）公司提供；2.2.15細(xì)胞，由國家新藥篩選中心提供；病毒株：流感甲型病毒（濟(jì)防90-15），流感乙型病毒（濟(jì)防97-13），在雞胚尿囊腔內(nèi)培養(yǎng)傳代（2008年11月），-80℃保存，由國家新藥篩選中心提供；病毒唑（RBV），新鄉(xiāng)藥業(yè)有限公司（批號：20080301）。

1.2 儀器

島津氣質(zhì)聯(lián)用儀GCMS-QP2010 Plus，島津公司。

表1 連翹揮發(fā)油化學(xué)成分分析

2 方法與結(jié)果

2.1 成分分析

2.1.1 色譜條件 RTX-1 MS色譜柱（30 m×0.25 mm），固定相厚度：0.25m，進(jìn)樣口溫度：250℃；色譜程序升溫條件為起始溫度：40℃，保持 3min，升溫速率：5℃/min，終點(diǎn)溫度 250℃保持 5min；載氣：氦氣，流量：2ml/min，壓力：28.8 kPa；分流比：100∶1，連接質(zhì)譜結(jié)口溫度 250℃，總流量：205 ml/min，進(jìn)樣量：1 μl（不含任何化學(xué)試劑）。

2.1.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)量范圍：m/z 20～400， 掃描間隔：0.50 s，掃描速度：833 D/s；檢測電壓：0.75 kV，電離電壓：70 eV，E1電離源，離子源溫度：200℃；獲取的質(zhì)譜數(shù)據(jù)用美國NIST08和WILEY7譜庫檢索。

2.2 抗乙型肝炎病毒活性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 測試原理 以2.2.15細(xì)胞為乙型肝炎病毒載體，測定樣品抑制乙型肝炎病毒進(jìn)行DNA復(fù)制和產(chǎn)生HBsAg、HBeAg的能力。

2.2.2 樣品處理 樣品臨用前溶于DMSO配成適當(dāng)濃度，檢測時(shí)用培養(yǎng)液作3倍稀釋，共8個(gè)稀釋度。

2.2.4 測試方法 2.2.15細(xì)胞種96孔培養(yǎng)板，36 h后按以上稀釋度分別加入樣品及陽性對照藥，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對照孔，加藥96 h后分別更換含不同稀釋濃度樣品的培養(yǎng)液，于加藥后第8天分別收集細(xì)胞上清液及2.2.15細(xì)胞，采用酶聯(lián)免疫法檢測細(xì)胞上清中HBsAg、HBeAg的分泌量，點(diǎn)雜交的方法檢測細(xì)胞中HBV DNA復(fù)制程度，分別計(jì)算IC50及SI。

2.3 抗流感甲、乙型病毒實(shí)驗(yàn)

2.3.1 測試原理 以MDCK（狗腎）細(xì)胞為病毒宿主，測定樣品抑制病毒引起細(xì)胞病變程度（CPE）。

2.3.2 樣品處理 樣品溶于DMSO，再用培養(yǎng)液配成適宜初始濃度，用培養(yǎng)液作3倍稀釋，各8個(gè)稀釋度。

2.3.3 測試方法 MDCK細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板，置5%CO2，37°C培養(yǎng)24 h。MDCK細(xì)胞分別加入流感甲型病毒10-4（316 倍 TCID50）、流感乙型病毒 10-3（316 倍 TCID50），37℃吸附2 h后傾去病毒液，分別加入不同稀釋度藥物。 設(shè)病毒對照和細(xì)胞對照，37°C培養(yǎng)40 h，觀察結(jié)果，記錄CPE，計(jì)算各樣品抗流感病毒半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.4 結(jié)果

連翹揮發(fā)油化學(xué)成分分析結(jié)果顯示其主要成分是α-蒎烯及β-蒎烯，總相對含量為71.48%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[2]，見表 1。連翹揮發(fā)油、β-蒎烯與 α-蒎烯對 2.2.15細(xì)胞的HBsAg、HBeAg分泌均無抑制作用，對2.2.15細(xì)胞的HBV DNA復(fù)制均無抑制作用；陽性對照藥3TC樣品對2.2.15細(xì)胞的HBsAg、HBeAg分泌均無抑制作用，對2.2.15細(xì)胞的HBV DNA 復(fù) 制 有 顯 著 抑制 作 用 ，IC50為 9.19 μg/ml；SI＞108.8，見表2；連翹揮發(fā)油、β-蒎烯與α-蒎烯對甲型流感病毒（濟(jì)防90-15）與乙型流感病毒（濟(jì)防97-13）均無抑制作用，見表 3。

表2 抗乙型肝炎病毒測試結(jié)果

注：-表示樣品在最大無毒劑量無抗病毒活性；TC50表示對細(xì)胞半數(shù)有毒濃度；IC50表示對病毒半數(shù)抑制濃度；SI表示選擇指數(shù)，SI=TC50/IC50

表3 抗流感甲、乙型病毒測試結(jié)果

3 討論

連翹抗病毒提取物主要是用連翹的水提物、醇提物、揮發(fā)油等；主要成分是苯乙醇苷類、黃酮類及木脂素類；抗病毒實(shí)驗(yàn)主要是針對呼吸系統(tǒng)的病毒如合胞病毒（RSV）、腺病毒7（Ad7）、柯薩奇 B 組病毒 3 型（CB3）、流感病毒甲 3 亞型（Fa3）、副流感病毒Ⅲ型（PF3）、埃柯病毒等以及單純皰疹病毒[1]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，連翹揮發(fā)油及其主要成分即α-蒎烯與β-蒎烯沒有抗流感病毒作用，這與文獻(xiàn)報(bào)道不一致[3]。文獻(xiàn)[3]未對連翹揮發(fā)油的成分進(jìn)行分分析，但是文獻(xiàn)[1]顯示不同產(chǎn)地與不同提取方法所得揮發(fā)油主要成分基本一致即α-蒎烯與β-蒎烯，由于實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩個(gè)主要成分均無抗病毒作用，證明它們均無直接的抗流感病毒作用。因此，文獻(xiàn)抗流感病毒的結(jié)果可能是連翹揮發(fā)油中的其他成分發(fā)揮的作用或者是連翹揮發(fā)油激活小鼠體內(nèi)其他途徑抑制流感病毒的作用。為此，在隨后的研究中我們將進(jìn)一步研究它們對流感病毒等病毒的作用。

[1]肖會(huì)敏,王四旺,王劍波,等.連翹揮發(fā)油的成分分析及其藥理作用的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2008,19(8):2047-2048.

[2]孫杰,姚健,達(dá)文燕,等.連翹揮發(fā)油化學(xué)成分的研究[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào),2001,37:77-81.

[3]馬振亞.連翹種子揮發(fā)油抗流感病毒等病原微生物作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].陜西新醫(yī)藥,1980,9(11):51.

[4]肖會(huì)敏,王四旺,王劍波,等.連翹抗病毒的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2010,7(2):9-10.

[5]夏忠弟,毛學(xué)政,羅映輝.α-蒎烯抗真菌機(jī)制的研究[J].湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1999,24(6):507.

[6]夏忠弟,余俊龍.α-蒎烯對白色念珠菌生物合成的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2000,10(1):44,46.

Com ponent analysis of forsythia essential oil and study on their anti-viral activity

XIAOHuimin,HEYue,WANGSiwang,WANGJianbo，XIEYanhua,MIAOShan
Institute of Materia Medical,School of Pharmacology,the Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China

Objective:To investigate the activity that inhibited influenza A and B virus and hepatovirus B(HBV)from Forsythia essential oil and itsmain components includingα-pinene andβ-pinene.Methods:①Using GC-MS to analyse the components of Forsythia essential oil.②Using 2.2.15 cells as HBV′s vector to determine the content of HBV DNA duplicated and HBsAg and HBeAg produced from them，respectively.③Using MDCK cells as host cells to observe the cytopathic effect(CPE)resulting from their inhabiting influenza A and B virus.Results：①Under themaximum nontoxic doses,itwas no inhibiting HBV′s activity that the concentration of Forsythia essential oilwas 258.69 μg/m l and the concentration ofα-pinene was 258.69 μg/ml and the concentration ofβ-pinene was 192.45 μg/ml.②Itwas no inhibiting influenza A and B viruses′activity that the concentration of Forsythia essential oil and α-pinene and β-pinene was 192.5 μg/ml,respectively.③Forsythia essential oil′s main components were α-pinene and β-pinene the amount of which was 71.48%.Conclusion:Forsythia essential oil and α-pinene and β-pinene were no inhibiting influenza A and B viruses and HBV′s activity.

Forsythia essential oil;α-pinene;β-pinene;Influenza virus;Hepatovirus B

R284.1

A

1673-7210（2011）03（b）-031-03

肖會(huì)敏（1975.12-），男，漢族，江西寧都人，碩士學(xué)歷，主管藥師，中藥物效基礎(chǔ)研究。

王四旺（1958.8-），男，漢族，湖北武漢人，碩士學(xué)歷，博士生導(dǎo)師，中藥物效基礎(chǔ)研究。

2011-01-10）