血經草總黃酮的提取工藝研究

于春月 ，張特立 ，劉新華 ，劉金杰 .哈爾濱醫科大學大慶校區藥學系，黑龍江大慶 6339；.大慶市人民醫院，黑龍江大慶 6336

血經草總黃酮的提取工藝研究

于春月1，張特立2，劉新華1，劉金杰11.哈爾濱醫科大學大慶校區藥學系，黑龍江大慶 163319；2.大慶市人民醫院，黑龍江大慶 163316

目的：優選血經草中總黃酮的最佳提取工藝。方法：以蘆丁為評價指標，考察黃酮提取率，通過正交試驗對回流法提取黃酮的工藝進行優化。結果：回流提取法的最佳工藝條件為，以1 g血經草為原料，100ml 60%乙醇為溶劑提取，提取時間為2 h，提取次數為1次；在該條件下，總黃酮的提取率為1.56%，RSD為1.43%（n=5）。結論：本工藝合理、可行。

血經草；分光光度法；黃酮；正交試驗；提取工藝

血經草為報春花科排草屬植物狼尾珍珠菜Lysimachia barystachys Bunge.的全草[1]，有活血調經，散瘀消腫，利水降壓的作用，多用于治療月經不調、痛經、咽喉腫痛等癥。研究表明，血經草的主要成分為黃酮類物質，包括槲皮素、蘆丁、山奈酚、金絲桃苷等[2]。目前關于血經草的相關研究較少，總黃酮的提取工藝研究更是鮮見報道。本文通過正交試驗設計考察了回流提取法中各因素對于血經草總黃酮提取率的影響，旨在通過確立最佳提取工藝，為血經草的進一步開發利用提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

756 MC型紫外-可見分光光度計（上海棱光技術有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；UV-7504PC紫外可見分光光度計 （上海欣茂儀器有限公司）；ESJ萬分之一電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）。

1.2 試藥

蘆丁標準品 （中國藥品生物制品檢定所批號：100080-200707），其他試劑均為分析純。血經草全草采自大慶市哈爾濱醫科大學大慶校區附近，由哈爾濱醫科大學大慶校區藥學系劉金杰教授鑒定為報春花科植物狼尾珍珠菜Lysimachia barystachys Bunge.，洗凈后放入烘箱60℃干燥，粉成粗粉，備用。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁標準品10mg，用60%乙醇溶液定溶于50ml量瓶中，配成濃度為0.2mg/ml的溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取血經草全草1 g，用100 ml 60%乙醇回流提取1 h，放冷，過濾，備用。

2.2 檢測波長的選擇

取對照品溶液3ml，置于10ml量瓶中，加60%乙醇成5m l，加 5%NaNO2溶液 0.3 m l，放置 6 min；加 10%Al（NO3）3溶液0.3ml，放置 6 min；加 1mol/m l NaOH 溶液 4ml，加 60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置10 min后，在紫外可見分光光度計上，于400～600 nm處測定最大吸收波長，最終確定為510 nm。

2.3 標準曲線的繪制[3]

精密量取對照品溶液 0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml于 6只10ml量瓶中，分別用60%乙醇補充至5 ml，加5%NaNO2溶液 0.3ml，放置 6min；加 10%Al（NO3）3溶液 0.3ml，放置 6min；加1 mol/ml NaOH溶液4ml，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置10 min后，以0.0 m l為空白對照，在510 nm處測定吸光度。以對照品溶液濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線。回歸方程為A=13.659C-0.0011（r=0.999 9，n=5）。結果表明蘆丁對照品在濃度為0.05～0.08mg/m l范圍內線性關系良好。

2.4 精密度試驗

取上述供試品溶液，按“2.3”項下方法操作，連續測定6次吸光度，并設立空白對照，結果RSD=0.99%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取供試品溶液，按“2.3”項下方法操作，分別放置0 min、20min、40min、60min、1 h、2 h、3 h、4 h 后測定吸光度，結果在1 h內RSD＜2%，表明樣品不穩定，應在1 h內測量。

2.6 重現性試驗

取上述藥材樣品，按照樣品溶液制備方法平行制備6份，依法測定，RSD=1.91%，表明本法重現性良好。

2.7 加樣回收率試驗[4]

向已知質量分數的樣品提取液中加入一定量的蘆丁對照品溶液進行試驗，結果顯示平均回收率為101.8%，RSD=2.11%，表明該法回收率良好。

2.8 正交試驗設計[5-6]

采用L9（34）正交試驗設計法，對回流提取法提取血經草中總黃酮的影響因素進行了考察，見表1。

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogona l test

2.9 樣品含量測定

取血經草粉末約1 g，置于100 m l圓底燒瓶中回流提取，按“2.8”項下方法進行正交試驗。精密吸取濾液3 ml于10m l量瓶中，按“2.3”項下方法操作進行顯色，測定吸光度，并計算總黃酮提取率，結果見表2。

由表2結果可知，以血經草為原料回流提取總黃酮各因素對黃酮提取率的影響順序為：D＞C＞B＞A，即提取次數＞提取時間＞乙醇用量＞乙醇濃度。最佳工藝為A1B3C3D1，即60%乙醇100m l，回流提取2 h，提取1次；在該條件下，黃酮提取率為 1.56%，RSD=1.43%（n=5）。

3 討論

正交試驗部分先采用單因素法確立最佳水平范圍，后采用多因素法考察整體影響度，這樣就避免了關鍵水平點被漏掉的錯誤發生，從而使整個實驗設計更具有科學性和嚴謹性。

硝酸鋁顯色法測定總黃酮的原理是：鋁離子與黃酮母核中的3位（或5位）上的羥基和4位羰基配合成穩定結構，從而可用比色法進行測量。血經草中報道的化學成分包括槲皮素、蘆丁、山奈酚、金絲桃苷以及一些黃酮苷類成分，它們結構中都普遍具有3位（或5位）羥基，因此選用此法進行含量測定。同時在預實驗中以蘆丁、槲皮素及山奈酚的混合溶液作為對照品溶液，在血經草全草的HPLC圖譜中顯示，蘆丁含量最高且分離度好，故選用蘆丁作為對照品溶液。

表2 正交試驗設計及結果Tab.2 Design and results of orthogonal test

由于樣品溶液顯色后有大量絮狀沉淀出現，故采用先過濾后測定的方法進行含量測定，但顯色后穩定性稍差，建議在1 h內測量完成。

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Study on optimal technology for extracting flavonoids from Lysimachia barystachys Bunge.

YUChunyue1,ZHANGTeli2,LIUXinhua1,LIUJinjie1

1.Department of Pharmacy,Daqing Campus of Harbin in Medical University,Daqing 163319,China;2.People's Hospital of Daqing,Daqing 163316,China

Objective:To optimize the bestextraction technology of Flavonoids in Lysimachia barystachys Bunge..Methods:Optimize the extraction technology on indexes of rutin content and the extraction ratio of Flavonoids by orthogonal test.Results:The optimal condition of extraction technology as follows:100 ml ethanolwith the concentration of 60%per gram of Lysimachia barystachys Bunge.,extraction time of 2 h，extraction times of 1 time;in this condition,the extraction rate of flavonoidswas1.56%with a RSD of 1.43%(n=5).Conclusion:The extraction technology is reasonable and practical.

Lysimachia barystachys Bunge.;Spectrophotometry;Flavonoids;Orthogonal design;Extracting technology

R284.2

A

1673-7210（2011）03（b）-060-02

黑龍江省衛生廳科技項目（項目編號：2007-491）。

于春月（1979-），女，碩士學歷，主要從事天然藥物化學成分研究。

2011-01-10）