反轉錄巢式多重聚合酶鏈式反應體系檢測單細胞中時鐘基因表達

袁艷鵬 關云謙 林慶玲 薛金花 蔡彥寧＊

(1.首都醫科大學宣武醫院神經生物學研究室,北京 100053;2.首都醫科大學宣武醫院細胞治療室,教育部神經變性病重點實驗室,北京 100053)

晝夜節律的產生依賴于時鐘基因間在“轉錄-翻譯-翻譯后加工”水平相互作用而形成的負反饋環路。其核心涉及 bmal1,clock,npas2,cry1,cry2,per1,per2,per3等多個時鐘基因[1-3]。clock(或 npas2)和 bmal1翻譯后產物能夠形成 clock/bmal1異源二聚體,結合于時鐘基因 per(per1、per2和 per3)和 cry(cry1和 cry2)的啟動子區,激活其轉錄,為正向調節因子;轉錄后的 per1、per2和 cry1、cry2在細胞質中得到翻譯,繼而形成 per/cry復合體轉位返回細胞核,通過直接相互作用,干擾 clock/ bmal1異源二聚體的轉錄活性,充當反向調控因子從而抑制 per和 cry自身的轉錄,由此形成負反饋調節環路[4-5]。由此,時鐘基因間構成環路,產生并維持了表達、生理以及行為學水平的晝夜波動。

時鐘基因廣泛表達于多種組織、器官,甚至永生化細胞系中。其表達豐度常呈晝夜波動。但時鐘基因是否表達于每個細胞中?不同細胞中波動時相是否相同?這些問題仍有待回答。為此,本研究建立了一種基于反轉錄巢式多重 PCR的、高度靈敏的、能夠在單細胞水平檢測多種時鐘基因表達的體系,成功檢測到單細胞水平時鐘基因的表達情況。

1 材料和方法

1.1 材料

主要試劑：SuperScript.Ⅲ First-Strand Synthesis System for RT-PCR RNA抽提試劑 TR Izol,0.25%胰蛋白酶 (美國 invitrogen公司);Qiagen○RMultiplex PCR Kit(德國 Qiagen公司);PCR MasterMix,Riboprobe○Rin vitro Transcription Systems(美國 Promega公司); Transcript RNA clean up kit,SYBR Green Master Mix (日本 TaKaRa公司);DMEM(Dulbecco’s modified eagle’smedium,high glucose);胎牛血清 FBS;內外側引物(引物序列見表 1)及 T7正向引物 (上海生物工程公司合成)。

儀器和耗材：PTC-100PCR儀,實時定量 PCR儀(美國MJ research公司);MM-33手動顯微操縱器 (美國WPI公司);紫外分光光度計(美國 GE公司);細胞培養皿(美國 Corning公司);玻璃電極 (中國醫學科學院提供)。

1.2 方法

1.2.1 N I H/3T3細胞培養

細胞培養的具體方案詳見文獻[6]：以1×106個N I H/3T3細胞接種在直徑10 cm的普通培養皿中,加入8～10 mL含 10%FBS的DME M培養基,2 d換液 1次,直至細胞生長覆蓋培養皿的 90%～100%,用0.25%胰蛋白酶消化細胞,得到單細胞懸液。高濃度血清 50% FBS刺激鋪滿培養皿的細胞分別持續 24 h和 36 h[7]。

表1 時鐘基因及內參基因引物序列、擴增長度Tab.1 Pr im er sequence and amplicon size of clock genes and housekeeping gene

1.2.2 N I H/3T3單細胞及群體細胞的獲取

胰酶消化后的單細胞懸液稀釋至 50～100個細胞/10 cm培養皿。在顯微鏡監測下,使用手動顯微操縱器移動玻璃電極接近目的細胞,給予一定的負壓將懸浮的細胞吸進電極內,取下電極將尖端折斷進 0.2 mL PCR管內,電極吸入無細胞培養基作為陰性對照[8]。將高血清刺激后的細胞用 0.25%胰蛋白酶消化后收集到 15 mL離心管內離心棄上清,得到約 5× 106群體細胞。

1.2.3 體外轉錄制備基因 RNA模板

以各基因質粒為模板,使用外側反向引物與帶 T7的正向引物,擴增出帶 T7的各基因片段。按照使用說明書,應用 Riboprobe○Rin vitro Transcription Systems制備相應 RNA模板,并使用 Transcript RNA clean up kit純化 RNA模板。

1.2.4 單細胞反轉錄

7種基因外側反向引物等濃度混合為 GSP引物(gene specific primer),每種基因引物濃度為 2μmol/ L。在含單細胞的 PCR管中,加入 GSP引物,dNTP (10 mmol/L)各 0.5μL,加水至 5μL,混勻。65℃孵育 5 min,按照操作手冊加入 superscriptⅢ反轉錄酶[9]及 RNAase out、10×緩沖液、MgCl2和 DTT進行反轉錄,得到 10μL cDNA產物。

1.2.5 群體細胞 RNA獲取及反轉錄

應用 TR Izol對群體細胞進行 RNA抽提,檢測RNA完整性良好進行反轉錄,與單細胞反轉錄過程相同,不再贅述。

1.2.6 巢式多重 PCR體系擴增條件

巢式外側多重 PCR擴增：反應體系25μL,7對基因外側引物等濃度混合,終濃度 0.1μmol/L,2×Qiagen○RMultiplex PCR MasterMix 12.5μL,預變性 95℃15 min,3步擴增法 94℃ 30 s,57℃ 3 min,72℃1 min,15個循環[10],循環后增加延伸 72℃10 min。

巢式內側單重 PCR擴增：反應體系 20μL,取外側擴增產物 1μL為模板,引物終濃度為 0.5μmol/L, 2×Promega PCRMasterMix 10μL,預變性 95℃10 s, 3步擴增法 95℃5 s,58℃12 s,72℃12 s,35個循環。群體水平巢式內側單重 PCR擴增換用 SYBR GreenMasterMix,余試劑及步驟相同。

1.2.7 擴增產物檢測

單細胞水平結果應用 2%瓊脂糖凝膠電泳及測序雙重檢測擴增條帶。群體水平應用實時定量 PCR檢測體系Opticon monitorⅡ檢測。

1.3 統計學方法

所有數據均應用 SPSS 11.5統計學軟件處理,不同組間表達差異比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 巢式 PCR外、內側擴增產物凝膠電泳

使用小鼠肝臟 cDNA為模板,使用各基因內、外側引物進行擴增。電泳顯示擴增出預期目的條帶(圖1),清晰、單一、無非特異條帶。擴增產物克隆入 pGMT載體,得到相關質粒,測序證實序列正確無誤 (結果未示)。

圖1 特異性引物擴增出時鐘基因外、內側單一條帶Fig.1 Single band of clock genes amplification w ith specific pr im ersA：gel electrophoresis of external PCR products;B：gel electrophoresis of internal PCR products;M：indicatesDNA marker; 1：actin;2：bmal1;3：clock;4：cry1;5：cry2;6：per1;7：per;0：negative control.

2.2 巢式多重 PCR檢測體系靈敏度檢測

使用紫外分光光度計定量各種質粒。混合稀釋至所需濃度,用于靈敏度分析。對于每個基因,分別使用 10、5、1個拷貝質粒為模板,進行 10個巢式 PCR擴增。如表 2,10或 5拷貝的各種基因均可得到100%檢測。1拷貝的 actin,bm al1,clock,per1,per2能夠得到 100%的檢測。1拷貝的 cry1檢出率為 80%, cry2檢出率為 90%。

表2 巢式多重 PCR檢測體系 DNA水平靈敏度Tab.2 DNA sensitivity of nested multiplex PCR

2.3 反轉錄巢式多重 PCR靈敏度檢測

在單個細胞中檢測基因表達,需要先將細胞中的mRNA反轉錄為 cDNA。為了 能在評估靈敏度時將反轉錄也納入考量,為此我們體外合成了各基因的RNA模板,電泳顯示 RNA完整(結果未示)。使用紫外分光光度計定量各種 RNA濃度,混合稀釋至所需濃度。分別使用 20、10、4個拷貝 RNA為起始模板,進行反轉錄和巢式多重 PCR擴增。如表 3所示,4個RNA拷貝的 cry2其檢出率達到 80%,其他基因均達到100%。

表3 巢式多重 RT-PCR檢測體系RNA水平靈敏度Tab.3 RNA sensitivity of nested multiplex RT-PCR

2.4 N IH/3T3單細胞時鐘基因檢測結果

使用顯微操作器,分別取出 10個單個 N I H/3T3細胞。細胞獲取過程如圖 2所示。對 10個單細胞及隨機的單細胞混合進行反轉錄多重巢式擴增,結果見表 4,每個細胞中時鐘基因表達譜差異明顯。

圖2 顯微鏡下單個目的細胞的獲取Fig.2 Co llecting single cellw ith m icroscope(10×)A：Glass electrode approaching the target cell;B：Single cell disappeared from the medium;C：Single cell in the glass electrode;Arrow points to single cell(magnification 10×).

表4 10個單細胞中時鐘基因檢測結果Tab.4 10 single cell results of clock genes

2.5 per1和 per2基因在群體水平和單細胞水平的表達差異

為了分析群體水平和單細胞水平是否存在差異。本研究利用實時定量 PCR和巢式多重RT-PCR分別研究了N I H/3T3細胞在群體和單細胞水平,時鐘基因per1和 per2在其表達高峰和低谷的表達。群體水平per1和 per2的表達量設定為 100%,相應低谷表達量分別為28.5%和 17.1%。高峰與低谷間差異均有統計學意義(P＜0.001)。在單細胞水平,per1表達高峰時陽性細胞率為 84.8%;表達低谷時陽性細胞率為 74.3%,差異無統計學意義 (P=0.128)。單細胞水平,per2表達高峰時陽性細胞率為 72.7%;表達低谷時陽性細胞率為 40.0%,差異有統計學意義(P＜0.001)。

3 討論

近年來,單細胞中基因表達的解析日益受到重視。同質細胞群體中的不同單細胞個體,其功能、結局卻千差萬別,這種差異是由不同細胞個體中的基因表達決定的。盡管眾多時鐘基因在組織、器官、細胞群體中的表達得到了廣泛的關注和研究,但針對單個細胞的研究仍然缺乏。為此,本研究建立了一種基于巢式多重PCR的、高度靈敏的、能夠在單細胞水平檢測多種時鐘基因表達的體系。結果顯示,該體系能夠檢出單拷貝DNA的各種時鐘基因。為了將反轉錄的因素也納入考量,我們還體外合成了不同時鐘基因的 RNA模板。結果顯示該體系能夠檢出至少4拷貝RNA的各種時鐘基因。將此體系應用于N I H/3T3細胞,成功地分析了單個細胞中時鐘基因的表達。該體系可以應用于諸多領域,并回答相應的生物學問題。如 Alvarez J D等[11]發現,時鐘基因在睪丸和胸腺組織中的表達不發生晝夜波動。組織化學分析顯示 per1和 clock并不在同一細胞中共表達。因此認為,非共表達的時鐘基因不能形成相互調控的網絡,從而阻礙了表達的晝夜波動。最近,Yagita K等[12]和 Kowalska E等[13]分別發現,胚胎干細胞中時鐘基因的表達也呈恒定狀態,再次提出非共表達的時鐘基因不能形成相互調控的網絡而阻礙了表達的晝夜波動的可能性。作為一種高度靈敏的檢測手段,本研究方法將能最終檢驗上述理論的正確與否。利用此體系,我們還初步比較了群體水平和單細胞水平 per1和 per2在不同時相的表達,結果顯示群體水平per2的晝夜波動伴隨著單細胞水平的陽性細胞的減少,而 per1則無此特點。提示兩者表達調控上的差異。

在所檢測的 10個 N IH/3T3細胞中,時鐘基因表達譜差異有統計學意義。提示不同細胞間節律的非同步化。這一結論尚有待檢測更多的單細胞加以驗證。bm al1和 clock能夠形成異源二聚體,是一對功能伙伴。per1和 per2、cry1和 cry2也分別構成功能對。研究[14-16]表明,只有 per1和 per2或 cry1和 cry2同時敲除掉,小鼠才徹底喪失節律。但各個功能對中基因兩兩表達是否相似,一直沒有定論。通過檢測單個N IH/3T3細胞,我們發現,功能對中兩基因表達差異有統計學意義。

總之,本實驗建立了高靈敏度的巢式多重 PCR檢測體系并成功地用于單細胞中時鐘基因表達的檢測,揭示了單細胞水平時鐘基因環路的異質性。

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