碳同位素在不同奶源鑒別中的應用探討

崔琳琳,劉衛國

(1.西安交通大學環境科學與工程系,陜西西安 710049;2.中國科學院地球環境研究所,黃土與第四紀國家重點實驗室,陜西西安 710075)

目前,食品安全問題受到全球的廣泛關注,而同位素技術的應用給食品安全研究提供了新方法,并已成功的應用于蜂蜜、果汁、葡萄酒、油脂等食品的摻假檢驗[1-4],以及判斷乳品、肉品等產地來源及追溯動物的飼料原料[5-7]等。

近年來,已有學者將穩定同位素技術應用到鑒別有機和非有機食品中,鑒別有機牛肉[8]或有機牛奶[9-10]。奶牛飲食中的同位素值通過食物鏈直接影響其產品的同位素值,因為對于動物源性食品,同位素比值雖然受動物代謝過程中同位素分餾的影響,但主要還是由飲食決定[11-12]的。有機奶是按有機標準生產,并經第三方嚴格認證的“最健康、最天然”的奶制品,與普通牛奶的不同主要在于飼料來源、奶牛的飼養方式。出產有機牛奶的奶牛是在天然牧場中放養、吃天然牧草長大的,牧草施的是天然肥料,兩者飼料來源的不同也使其所產奶的同位素值有所不同。

奶牛攝入飼料的類型同樣可以影響牛奶中的脂肪酸[13-14]。國外一些學者研究了有機牛奶與普通牛奶在脂肪酸含量方面的區別[9-10,15-17],認為有機奶的多不飽和脂肪酸及亞麻酸含量相對較高,但對于亞油酸的結果有些不同。Bergamo[15]和 Collomb[16]認為有機奶含有較多的亞油酸;而Molkentin[9-10]和 Ellis[17]則認為兩者的亞油酸含量沒有較大區別。在國內的報道中,普通奶與有機奶在脂肪酸含量上的區別還沒有明確提出。

目前的研究表明,通過生物標記物和同位素手段鑒別有機和非有機牛奶可能會成為國際趨勢。本實驗主要是研究市售及奶源牛奶的脂肪酸及其穩定碳同位素,初步揭示國內一些品牌牛奶在脂肪酸、碳同位素方面的差異,特別是普通牛奶與有機奶的區別,并探討奶牛飼料來源等方面的問題對這些指標的影響。

1 試驗部分

1.1 樣品采集

1.1.1 市售牛奶的采集 同一季節,在超市采購8種品牌的普通純牛奶,代號分別為SSP-1～SSP-8,其中,SSP-1和 SSP-2同時有有機奶SSO-1和 SSO-2。

1.1.2 奶牛場的牛奶采集 取自陜西省西安市臨潼區油槐鎮的兩處奶牛場,代號為NCP-1及NCP-2,這里的奶牛均采用家用飼料喂養,認為是普通奶源的代表。

1.1.3 天然牧場奶源 取自青海湖畔天然放牧的兩處奶牛場,代號為 MCO-1及MCO-2,這些奶牛都處于天然放牧狀態,飼料為天然牧草,認為是有機奶源的代表。樣品信息列于表1。

表1 牛奶的采樣信息Table 1 The information of milk collection

1.2 儀器與試劑

二氯甲烷、甲醇、正己烷、乙酰氯、脂肪酸標準物質(C12～C24)(均為色譜純):德國 Meker公司產品;氯化鈉(分析純):由天津市北方天醫化學試劑廠提供。

FD-1A-50型冷凍干燥機:北京博醫康實驗儀器有限公司產品;KQ-100DE型超聲振蕩器:昆山市超聲儀器有限公司產品;氣相色譜儀:美國Agilent公司產品,帶有自動進樣器;MAT-252型同位素質譜儀:美國 Thermo公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取并測定牛奶中的脂肪酸含量 將牛奶置于冰箱中冷凍成固體,然后在冷凍干燥機中凍干。稱約50 mg牛奶粉末于燒杯中,加入V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=2∶1的混合溶液,超聲震蕩15 min,提取3次,將上清液吹干,向干燥的樣品中加入3 mL鹽酸化甲醇(V(甲醇)∶V(乙酰氯)=95∶5,在將乙酰氯加入甲醇之前,將甲醇冷凍至少30 min,避免反應過于劇烈)和少量的N2,立即蓋上蓋子,60℃加熱12 h(overnight),將酯化后的樣品冷卻至室溫,轉移至長玻璃管中,加入3mL 5%NaCl溶液和4 mL正己烷,用Vortex抽提,取上層清液于小瓶中,吹干,用正己烷定容,做 GC分析(此實驗方法參考文獻[18])。

色譜柱:HP-1MS毛細管色譜柱(60.0 m×320μm×0.25μm);升溫程序:初始溫度40 ℃,保持1 min,以10℃/min升溫至150℃,再以6℃/min升溫至315 ℃,保持20 min;載氣:氦氣;進樣口溫度310℃;進樣量1μL;分流比4.0∶1;柱流速 1.3 mL/min;檢測器 FID溫度320℃。

1.3.2 測定牛奶中的有機碳同位素 取約1 mg凍干的牛奶粉末于石英管內,加入氧化銅、銅絲和鉑絲,抽好真空后密封,置于馬弗爐內,850℃下恒溫灼燒4 h,充分氧化。樣品爐冷卻至室溫后,在真空系統中用酒精-液氮冷阱收集純化CO2氣體,最后用MAT-252型同位素質譜儀測定CO2的碳同位素。

碳同位素組成的表達式為:

式中:R樣品為樣品的碳同位素比值(13C/12C),R標準為標準的碳同位素比值(13C/12C)。

碳同位素組成相對于V-PDB標準。樣品的測定精度用實驗室工作標準控制,每批樣品至少帶一個工作標準,標準樣品的重復分析誤差小于0.2%。

2 結果與討論

2.1 牛奶樣品的脂肪酸種類及含量

根據牛奶脂肪酸的氣相色譜圖,采用面積歸一化法定量,計算各脂肪酸的百分含量(g/100g脂肪酸總量),結果列于表2。

從表2可以看出,牛奶中飽和脂肪酸含量較高,以豆蔻酸(C14:0)、棕櫚酸(C16:0)及硬脂酸(C18:0)為主,3種脂肪酸占脂肪酸總量的50%以上,低級(碳14個以下)脂肪酸含量較低;而不飽和脂肪酸主要以油酸(C18:1)、亞油酸(C18:2)、十六烯酸、十四烯酸、二十碳四烯酸、亞麻酸(C18:3n-9,12,15)等為主。而且,各種品牌的牛奶中主要脂肪酸含量沒有明顯差別,而這幾種牛奶分別采自不同地區,這也表明地區差異對脂肪酸含量的影響較小。但對于普通奶與有機奶來說,有些脂肪酸含量稍有差別,主要體現在有機奶的PUFA含量明顯高于普通奶,在MUFA方面差別不顯著,而SFA含量稍低于普通奶。在多不飽和脂肪酸含量上的差別,以亞麻酸與亞油酸最為顯著。這與奶牛所食飼料有關,奶牛瘤胃內的細菌可氫化75%～90%亞油酸和85%～95%亞麻酸,而奶牛攝入的高含量不飽和脂肪酸口糧能抑制奶牛瘤胃內多不飽和脂肪酸氫化,或者直接或間接地影響瘤胃環境(如p H),從而影響脂肪酸在瘤胃中的新陳代謝以及脂肪酸的含量[19-20]。新鮮牧草相比于農家飼料含有較高的多不飽和脂肪酸和高比例的亞麻酸,這就使以新鮮牧草為主要飼料的奶牛比以農家飼料為主要飼料的奶牛所產牛奶的脂肪酸含量相對較高。表2為所測不同類型牛奶樣品的平均值,普通奶的亞麻酸含量在0.15%左右,而有機奶的亞麻酸含量在0.36%以上,與 Molkentin[10]研究的有機奶的亞麻酸含量有區別,這與脂肪酸的提取方法不同有關;而有機奶亞油酸含量比普通奶高出2%以上,這與 Molkentin[10]研究的結果不同,但與Bergamo[15]和 Collomb[16]的研究結果一致。

2.2 牛奶碳同位素比值分析

2.2.1 普通奶與有機奶的碳同位素比值 實驗比較了市售的相同品牌的普通奶與有機奶,以及兩處奶源地的牛奶,碳同位素比值結果列于表3。可以看出,有機奶場所產牛奶的碳同位素值在-27‰～-30‰之間,而普通奶場所產牛奶的δ13C為-16‰左右,從奶牛場來說,有機牛奶的δ13C值比普通奶的偏負很多;對于市售牛奶,普通牛奶的δ13C值為-16‰左右,而有機牛奶的δ13C值在-18‰～-20‰之間,較普通牛奶稍微偏負。

δ13C值反映了奶牛飼料中C3植物與C4植物的比例,即飼料中C3及C4植物的比值。植物的δ13C值與光合作用方式有關,C3植物δ13C值的變化范圍為-23‰～-35‰,平均值約為-27‰,C4植物δ13C值的分布范圍在-9‰～-19‰之間,平均值約為-13‰[21]。奶牛所食飼料中C3與C4植物配比不同,其所產牛奶的δ13C值也不同,列于表4。有機奶較普通奶的值偏負可以解釋為出產有機牛奶的奶牛是在天然牧場中放養、吃天然牧草長大的,這些牧草可能會摻雜一些C4植物,但大部分都是C3植物[16,22];而出產普通奶的奶牛是在一般圈養的養殖場長大,它們基本上以農業玉米飼料為食,玉米是典型的C4植物,其δ13C偏正[2,16]。奶牛所食飼料的C3與C4植物比例就解釋了其所產牛奶同位素值的差異。

表2 各市售普通純牛奶的脂肪酸含量(g/100 g脂肪酸總量)Table 2 The content of fatty acids in various convention milk(g/100 g fatty acids)

表3 普通奶與有機奶平均脂肪酸含量(g/100 g脂肪酸總量)的差異Table 3 The difference of fatty acids content(g/100 g fatty acids)between convention and organic milk

表4 普通奶與有機奶的碳同位素δ13C對比Table 4 The carbon stable isotope ratio δ13C in convention and organic milk

另外,對于市售牛奶,為了使牛奶的保存期更長,廠商會進行高溫處理或者加入一些添加劑,這可能使碳同位素之間有分餾,導致市售有機奶的碳同位素值較C3植物-23‰～-35‰的范圍稍偏正,但這不影響有機奶與普通奶之間的同位素差異。

2.2.2 不同品牌牛奶的碳同位素比值 實驗測定了8種不同品牌牛奶的碳同位素值,列于表5。結果表明,現市售的8種牛奶的同位素值沒有明顯區別,并與奶牛場的新鮮牛乳的同位素值接近。這些牛奶都是普通奶,所產這些牛奶的奶牛主要是以農業飼料為食,其碳同位素值在C4植物δ13C值的變化范圍內,而這些農業飼料更多的是玉米飼料,不會因為地區不同而不同,所以對于這些市售普通牛奶,地區差異對其δ13C值的影響較小。

表5 8種品牌鮮牛奶的碳同位素值δ13CTable 5 The carbon stable isotope ratio δ13C in various convention fresh milk

3 結論

通過對不同奶源的初步研究得出以下結論:

1)對于市售不同品牌的普通純牛奶,其脂肪酸含量和碳同位素比值沒有明顯差異,并且地區差異影響較小。

2)有機奶相比普通奶,其多不飽和脂肪酸含量相對較高,尤其在亞麻酸和亞油酸含量方面差異比較顯著,普通奶的亞麻酸含量在0.15%左右,而有機奶的亞麻酸含量在0.36%以上,有機奶的亞油酸含量比普通奶高出2%以上。

3)有機奶的碳同位素比值相比普通奶明顯偏負,因為出產有機奶的奶牛主要以天然牧草(C3植物)為食,而出產普通奶的奶牛飼料中更多的是家用飼料玉米(C4植物)。

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