利用QqQ-MS碰撞能量自動優化功能確定磷脂脂肪酰基位置

蘇小玲,徐繼林,陳娟娟,趙 鵬,嚴小軍

(寧波大學,應用海洋生物技術教育部重點實驗室,浙江寧波 315211)

利用QqQ-MS碰撞能量自動優化功能確定磷脂脂肪酰基位置

蘇小玲,徐繼林,陳娟娟,趙 鵬,嚴小軍

(寧波大學,應用海洋生物技術教育部重點實驗室,浙江寧波 315211)

利用三重四極桿質譜碰撞能量自動優化功能,在正、負離子檢測模式下,對磷脂標準品(包括 PA,PC,PE,PS,PG,PI)不同碰撞能量下子離子的裂解規律進行研究。實驗發現:在負離子模式下,各類磷脂的子離子[M-H-R2COOH]-強度總是高于[M-H-R1COOH]-強度,而[M-H-R’2CH=CO]-豐度總是高于[M-H-R’1CH=CO]-豐度,這個規律可以用于確定左右磷脂的酰基位置。另外,在負離子模式下,PA和PS母離子裂解產生的羧酸陰離子豐度比均為R1COO-高于R2COO-,PC則為R1COO-低于R2COO-;在正離子模式下,PS裂解產生的酰基陽離子R1CO+豐度總是低于R2CO+,PA和PC在低碰撞能量下,sn-1脂肪酰基基團作為烯酮的中性丟失而產生離子豐度總是低于sn-2位上產生的對應離子;而PE和PG的sn-1位脂肪酰基基團作為羧酸的中性丟失而產生的離子在低碰撞能量下的豐度高于sn-2位上產生的離子。這些規律可用于輔助確定磷脂脂肪酰基的位置。

三重四極桿質譜;磷脂;脂肪酰基位置

天然磷脂是含磷酸的類脂化合物,它除了構成生物膜外,還參與細胞膜對蛋白質的識別和信號傳導功能[1],同時,在影響植物光合作用效率[2-3]等方面也發揮著重要作用。磷脂的基本結構示于圖1。同一類磷脂之間的差別體現在酰基脂肪酸組成和位置的不同,而確定磷脂不同位置的脂肪酰基組成對研究生物體磷脂的合成途徑有著重要的意義[4]。

圖1 磷脂的基本結構Fig.1 The general structure of glycerophospholipids

目前,多采用三重四極桿質譜(QqQ-MS)或線性離子阱質譜(L IT-M S)研究磷脂脂肪酰基的裂解規律[5-10],但均是取某一特定碰撞能量研究磷脂的裂解情況,而并未將整個碰撞能量范圍進行全面的考慮。Hvattuma等[11]研究發現,18:0/20:4 PE在低碰撞能量下更有利于 sn-2的丟失,而在高能量下,sn-1則更易丟失。這說明某些磷脂在不同碰撞能量下其子離子的相對豐度會發生變化。三重四極桿質譜碰撞能量自動優化功能可以直觀給出同一母離子的不同子離子豐度與碰撞能量的變化曲線,從而根據各離子相對豐度的變化來研究磷脂分子中不同酰基的位置。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Quantum Access三重四極桿質譜聯用分析系統:美國 Thermo Fisher公司產品;超純水系統:美國M illipore公司產品。

磷脂酸(PA)、卵磷脂(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)標準品:美國Avanti Polar Lipids公司產品;甲酸(色譜純):美國 Sigma-A ldrich公司產品;其他試劑(色譜純):美國 Tedia公司產品;純水由超純水系統制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 取各標準溶液,用甲醇稀釋至 1 g/L,再用V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(乙酸銨)=300∶665∶35的溶液進一步稀釋至10 mg/L,直接進樣上機分析。

1.2.2 質譜條件 采用電噴霧電離(ESI)源正、負離子電離模式,噴霧電壓2 800 V,鞘氣流量12 L/m in,輔助氣流量 4 L/m in,離子傳輸毛細管溫度350℃,選擇反應監測(SRM)模式,碰撞室能量采用5～80 V進行掃描。正離子模式下蠕動泵流速10μL/m in;負離子模式下蠕動泵流速 8μL/min。碰撞氣為氬氣,碰撞氣壓力23.79 Pa。

2 結果與討論

2.1 負離子模式下各磷脂分子裂解規律

磷脂骨架是甘油骨架,其中sn-1和sn-2位兩個羥基通過酯鍵分別連接兩個脂肪酸鏈,另一羥基連接極性頭部。ESI源負離子模式下,磷脂多以[M-H]-離子存在,對其做二級質譜分析,在5～80 V范圍內改變碰撞能量,觀察得到的子離子形式包括sn-1羧酸陰離子(R1COO-),sn-2羧酸陰離子(R2COO-),也會形成對應于 sn-1和sn-2位脂肪酰基基團作為羧酸和烯酮的中性丟失而產生的離子[M-H-RXCOOH]-和[M-H-R’XCH=CO]-(RX=RX’CH2)。

選擇得到的子離子作為研究對象,利用三重四極桿質譜碰撞能量自動優化的功能,對產生相應子離子的碰撞能量進行自動優化,儀器可以自動給出各子離子豐度隨著碰撞能量改變而變化的曲線,示于圖2。

2.1.1 羧酸陰離子(RXCOO-)的裂解規律以PA為例,圖2是 16∶0/18∶1 PA的m/z673([M-H]-)母離子產生子離子時,碰撞能量自動優化后各子離子豐度隨著碰撞能量變化而變化的曲線。從圖中可以看出,在碰撞能量變化的整個范圍內,處在sn-1位的脂肪酰基基團形成的m/z255負離子(R1COO-)的豐度總是大于處在sn-2位的脂肪酰基基團形成的m/z281(R2COO-)(圖2a),此規律在 18∶0/22∶6 PA的m/z747([M-H]-)母離子產生的相應子離子變化中同樣出現。可見在本實驗中,無論是16∶0/18∶1 PA 還是 18∶0/22∶6 PA,都是sn-1位更容易斷裂,在對應變化圖上位于上方的曲線代表的酰基基團就位于sn-1,位于下方的曲線代表的酰基基團就位于 sn-2位。Hsu等[5]利用 ESI源QqQ-M S在低碰撞能量下研究了 PA的裂解規律,發現 16∶0/18∶1、18∶0/20∶4 PA子離子豐度比為 R1COO-＞R2COO-。因此可以認為,PA的子離子豐度R1COO-總是大于R2COO-。

圖2 16∶0/18∶1 PA[M-H]-離子所產生的不同子離子在不同碰撞能量下的相對豐度Fig.2 The relative intensity of product ion arising from the dissociation of[M-H]-ion of C16∶0/18∶1 PA at different collision energies

對于其他磷脂而言,由于極性頭部的不同,各子離子豐度隨著碰撞能量變化的規律并不一致。Vensen[12]利用快原子轟擊質譜(FAB-M S)研究PC負離子模式時的裂解情況,發現sn-2位羧酸陰離子的相對豐度大約是sn-1位的2倍;而 Hsu等[6]利用多級串聯離子阱質譜詳細研究正負離子模式下的 PS裂解,發現負離子模式下R1COO-的豐度高于 R2COO-。他們均是取某一特定碰撞能量研究磷脂的裂解情況,而并未將整個碰撞能量范圍進行全面考慮。本實驗另外選取 2種 PA、PC、PS、PE、PG、PI,觀察其在不同碰撞能量下羧酸陰離子的相對豐度,結果列于表1。由表1可知,與 PA類似,PS sn-1位的羧酸陰離子豐度也總是高于sn-2位,即 R1COO-＞R2COO-。Hvattuma等[11]研究了 18∶0/20∶4 PS、PA,也得到了相同的規律,這證實了本實驗結果的正確性。而對于PC而言,無論是14∶0/18∶1還是 18∶1/14∶0,結果均顯示R2COO-＞R1COO-。Han等[13]研究了碰撞能量為18～25 V PC(16∶0/18∶1、16∶0/18∶2、18∶0/18∶1、16∶0/20∶4),發現 sn-2位產生的羧酸陰離子是sn-1位的3倍,這與本實驗得到的結果一致。

這種具有同樣酰基陰離子相對豐度大小的規律并非存在于所有磷脂裂解過程中。有報道指出,磷脂分子甘油骨架上酰基鏈的位置對分子離子解離影響較大,sn-1與sn-2裂解豐度比值取決于sn-2位上酰基鏈的長短及不飽和鍵的數目[13]。本實驗中,PE、PG、PI在負離子模式下羧酸陰離子未發現一致的規律。例如 PG,16∶0/18∶1 PG在不同的碰撞能量下,R2COO-曲線始終高于 R1COO-曲線;而對于18∶0/22∶6 PG而言,當碰撞能量在5～30 V時,sn-1位酰基離子豐度與sn-2位幾乎一樣,當能量提高時,R1COO-豐度高于R2COO-豐度,示于圖3,所以無法用這兩個離子的相對豐度變化來定性這些磷脂的酰基位置。

表1 各類磷脂標準品在5～80 V碰撞能量下,sn-1和sn-2位羧酸陰離子的相對豐度比Table 1 The relative abundance ratio of carboxylate anion from sn-1 or sn-2 from 6 classes of phospholipids under different collision energies(5～80 V)

2.1.2 負離子模式下[M-H-R’XCH=CO]-,[M-H-RXCOOH]-的裂解規律 仍以PA為例,進一步觀察16∶0/18∶1 PA的m/z673([M-H]-)母離子產生的其他子離子可見,子離子m/z391[M-H-R2COOH]-的豐度在各碰撞能量下總是高于m/z417[MH-R1COOH]-;而子離子m/z409[M-HR’2CH=CO]-的豐度始終高于m/z435[MH-R’1CH=CO]-,這些結果說明 ,16∶0/18∶1 PA的sn-2位比sn-1位更有利于脂肪酰基基團作為羧酸和烯酮的中性丟失。

從表1可見,PE、PG、PI各羧酸陰離子的豐度之間沒有類似 PA、PC、PS所具有的共同規律。為了確認PA、PC、PS其他子離子是否也具有一致的裂解規律,進一步考察了其他子離子之間的豐度變化。選擇對比[M-H-R’XCH=CO]-、[M-H-RXCOOH]-相對離子豐度發現,隨著碰撞能量的增加,所有標準脂[M-HR1COOH]-豐度總是小于[M -HR2COOH]-,同時 ,[M-H-R’1CH=CO]-豐度也總是小于[M-H-R’2H=CO]-。Hsu等[7-10]在某一能量下對 PE 18∶0/16∶0,PG 18∶1/16∶0、18∶0/20∶4,PI的研究也得到了同樣的結論。故這6種磷脂分子均可根據[MH-R’XCH=CO]-或[M-H-RXCOOH]-(PC根據[M-H-CH3-R’XCH=CO]-或[M-H-CH3-RXCOOH]-,PS根據[M-H-87-R’XCH=CO]-或 [M-H-87-RXCOOH]-,且X=1,2)豐度直接確定酰基所在的位置。但是由于羧酸陰離子的豐度都高于其他子離子的豐度(例如 PA),所以對于PA、PC、PS 來說 ,用 R1COO-和 R2COO-豐度比確定酰基所在位置更簡便、直觀。

2.2 正離子模式下各磷脂分子裂解規律

2.2.1 PA ESI源正離子模式下,PA多以[M+H]+離子存在,同時,PA易發生中性丟失極性頭部(H3PO4)而產生[M+H-98]+子離子。以 16∶0/18∶1 PA為例,對[M+H-98]+做二級質譜,觀察所產生的碎片離子,發現包含裂解產生的m/z339[M+H-98-R’1CH=CO]+、m/z313[M+H-98-R’2H=CO]+。另外,PA[M+H-98]+做二級質譜碎裂得到酰基陽離子分別為m/z239 R1CO+和m/z265 R2CO+。

比較上述觀察所得到的子離子相對豐度,發現m/z239的相對豐度低于m/z265,但在整個碰撞能量范圍內,二者的豐度比較接近;在低碰撞能量(＜30 V)下,m/z339相對豐度明顯低于m/z313,在碰撞能量30～45 V下,m/z339的豐度則高于m/z313。對18∶0/22∶6 PAm/z651[M+H-98]+做二級質譜,觀察到m/z267(R1CO+)豐度明顯高于m/z311(R2CO+)。當碰撞能量小于50 V時,m/z385[M+H-98-R’1CH=CO]+豐度明顯低于m/z341[M+H-98-R’2H=CO]+;當碰撞能量高于45 V時,二者的豐度均很低。對于m/z367[M+H-98-R1COOH]+和m/z323[M+H-98-R2COOH]+而言,在能量小于40 V時,m/z367明顯高于m/z323。據此,在低碰撞能量下可以根據[M+H-98-R’1CH=CO]+和[M+H-98-R’2H=CO]+的相對離子強度確定 PA酰基所處的位置。

2.2.2 PC 14∶0/18∶1 PC和18∶1/14∶0 PC在正離子模式下不僅可以產生[M+H]+離子,還可以產生[M+Na]+,但[M+Na]+信號強度較低,故選擇[M+H]+離子做二級質譜。對兩種PC酰基陽離子做碰撞能量自動優化,得到的信號強度均很低,不利于做比較。在本實驗中,發現sn-2位比sn-1位更有利于脂肪酸酰基基團丟失,這體現在碰撞能量小于50 V時,[M+H-R’2H=CO]+的相對豐度高于[M+H-R’1H=CO]+(能量大于 50 V時,[M+H-R’XH=CO]+信號強度很低,接近于 0)。Hsu等[6]利用串聯四極桿質譜研究了16∶0/18∶1 PC,同樣發現了正離子模式下[M+HR’2H=CO]+的相對豐度總是高于[M+HR’1H=CO]+。所以,對于 PC而言,正離子模式下脂肪酰基在甘油骨架的位置可通過此規律來確定。

2.2.3 PE PE易中性丟失C2H8O4NP(141 u)形成[M+H-141]+離子 ,故 16∶0/18∶1 PE和18∶0/22∶6 PE的母離子m/z718[M+H]+和m/z792[M+H]+在正離子模式的主要子離子是m/z577和m/z651。觀察 16∶0/18∶1 PE的其他子離子,發現R1CO+豐度明顯低于R2CO+;[M+H-141-R1COOH]+的離子豐度在碰撞能量小于35 V時總是高于[M+H-141-R2COOH]+豐度,高碰撞能量下二者得到的信號均很低;另外,能量小于30 V時,m/z339[M+H-141-R’1H=CO]+的強度高于m/z313[M+H-141-R’2H=CO]+,能量大于30 V時,m/z339低于m/z313,示于圖4。觀察18∶0/22∶6 PE則發現,R1CO+豐度總是高于R2CO+,[M+H-141-R1COOH]+的離子豐度總是高于[M+H-141-R2COOH]+豐度 ,[M+H-141-R’1H=CO]+的強度低于[M+H-141-R’2H=CO]+。仔細分析上述規律,可發現共有規律為PE所產生的子離子[M+H-141-R1COOH]+豐度在低碰撞能量下總是高于[M+H-141-R2COOH]+豐度,因此,可以直接確定出PE酰基所處的位置。

圖4 16∶0/18∶1 PE子離子[M-140-R1 COOH]+和[M-140-R2 COOH]+的相對離子強度Fig.4 The relative intensity of the[M-140-R1COOH]+and the[M-140-R2 COOH]+from C16∶0/18∶1 species of PGat different collision energies

2.2.4 PG PG在正離子模式下極易丟失包括磷酸在內的極性頭部基團而形成特征離子[M-171]+。另外,16∶0/18∶1 PG[M+H]+離子強度很低,故選擇[M-171]+做二級質譜,分別觀察比較16∶0/18∶1 PG和18∶0/22∶6 PG子離子的相對強度,結果發現:16∶0/18∶1 PG碎裂形成的酰基陽離子相對強度為R1CO+低于R2CO+,而18∶0/22∶6 PG碎裂形成的酰基陽離子相對強度為R1CO+高于R2CO+;但兩種PG丟失脂肪酰基基團作為烯酮的中性丟失而產生的離子[M-171-R’XH=CO]+均為[M-171-R’1H=CO]+的強度高于[M-171-R’2H=CO]+。故正離子模式下,PG可根據 M-171-R’1H=CO]+和[M-171-R’2H=CO]+相對強度來確定脂肪酰基位置。

2.2.5 PS PS在正離子 ESI源下易形成[M+H]+離子,此類離子也易通過失去極性頭部基團而產生[M-184]+。分別對 16∶0/18∶1PS和18∶0/18∶1 PS的[M+H]+離子做二級質譜發現,這兩種PS裂解形成酰基陽離子的相對離子豐度均為R1CO+低于R2CO+,而其他子離子的相對豐度則較低。所以對于 PS而言,正離子模式下可根據R1CO+和R2CO+相對豐度高低直接確定酰基的位置。

3 結論

綜上所述,ESI源負離子模式下,PA、PC、PS、PE、PG、PI均可以根據 [M-H-R’XCH=CO]-或[M-H-RXCOOH]-(PC根據[M-H-CH3-R’XCH=CO]-或[M-HCH3-RXCOOH]-,PS根據[M-H-87-R’XCH=CO]-或 [M-H-87-RXCOOH]-,且X=1,2)相應的相對離子強度大小來確定磷脂脂肪酰基的位置,即[M-HR2COOH]-的離子強度總是高于[M-HR1COOH]-強度 ,而[M-H-R’2CH=CO]-豐度總是高于[M-H-R’1CH=CO]-豐度。

考慮到某類磷脂在一定條件下,上述離子豐度可能較低,則可以選擇其他離子豐度比變化來進行輔助定性。在負離子模式下,對于 PA、PC、PS而言,可利用sn-1、sn-2位羧酸陰離子的豐度比來確定酰基的位置,其中PA和 PS母離子裂解產生的羧酸陰離子豐度比均為 R1COO-＞R2COO-,PC則為 R1COO-＜R2COO-。由于PA、PC、PS產生的羧酸陰離子的豐度都高于其它子離子的豐度,故利用 R1COO-和 R2COO-的豐度比確定酰基所在位置是簡便、直觀的。

在正離子模式下,PS的酰基陽離子R1CO+豐度總是低于R2CO+;PA和PC在低碰撞能量下,sn-1脂肪酰基基團作為烯酮的中性丟失而產生的離子豐度總是低于sn-2位上產生的對應離子;而對于PE和 PG而言,在低碰撞能量下,其sn-1脂肪酰基基團作為羧酸的中性丟失而產生的離子豐度高于sn-2位上產生的對應離子。這些規律可以作為對應磷脂在對應條件下的輔助定性。

[1]WANG X M.Lipid signaling[J].Current Opinion in Plant Biology,2004,7(3):329-336.

[2]HAGIO M,GOMBOS Z,VáRKONYI Z,et al.Direct evidence for requirement of phosphatidylglycerol in photosystem IIof photosynthesis[J].A-merican Society of Plant Physiologists,2000,124(2):795-804.

[3]JONESM R.Lipids in photosynthetic reaction centres:Structural roles and functional holes[J].Progress in Lipid Research,2007,46(1):56-87.

[4]SOM ERV ILLE C,BROWSE J.Plant lipids:Metabolism,mutants,and membranes[J].Science,1991,252(5 002):80-87.

[5]HSU F F,TURKJ.Charge-driven fragmentation processes in diacyl glycerophosphatidic acids upon low-energy collisional activation.A mechanistic p roposal[J].J Am Soc Mass Spectrom,2000,11(9):797-803.

[6]HSU F F,TURK J.Studies on phosphatidylserine by tandem quadrupole and multip le stage quadrupole ion-trap mass spectrometry with electrosp ray ionization:Structural characterization and the fragmentation processes[J].J Am Soc Mass Spectrom,2005,16(9):1 510-1 522.

[7]HSU F F,TURK J.Charge-remote and chargedriven fragmentation processes in diacyl glycerophosphoethanolamine upon low-energy collisional activation:A mechanistic p roposal[J].J Am Soc Mass Spectrom,2000,11(10):892-899.

[8]HSU F F,TURK J.Studieson phosphatidylglycerol with triple quadrupole tandem mass spectrometry with electrosp ray ionization:Fragmentation processes and structural characterization[J].J Am Soc Mass Spcctrom,2001,12(9):1 036-1 042.

[9]HSU F F,TURK J.Characterization of phosphatidylinositol, phosphatidylinositol-4-phosphate,and phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate by electrosp ray ionization tandem mass spectrometry:A mechanistic study[J].J Am Soc Mass Spcctrom,2000,11(11):986-999.

[10]HSU F F,TURK J.Electrosp ray ionization with low-energy collisionally activated dissociation tandem mass spectrometry of glycerophospholipids:Mechanisms of fragmentation and structural characterization[J].Journal of Chromatography B,2009,877(26):2 673-2 695.

[11]HVA TTUM E,HAGEL IN G,LARSEN A.Study of mechanism s involved in the collision-induced dissociation of carboxylate anions from glycerophospholipids using negative ion electrosp ray tandem quadrupole mass spectrometry[J].Rapid Commum Mass Spectrom,1998,12(19):1 405-1 409.

[12]JENSEN N J,TOM ER KB,GROSSM L.Fast atom bombardment and tandem mass spectrometry of phosphatidylserine and phosphatidylcholine[J].Lipids,1986,21(9):580-588.

[13]HAN X L,GROSS R W.Structural determination of picomole amounts of phospholipids via electrosp ray ionization tandem mass spectrometry[J].J Am Soc Mass Spcctrom,1995,6(12):1 202-1 210.

Characterization of Fatty Acyl Location in Phospholipids by Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometry Using the Function of Collision Energy Automatic Optim ization

SU Xiao-ling,XU Ji-lin,CHEN Juan-juan,ZHAO Peng,YAN Xiao-jun
(Key Laboratory of A pp lied M arine Biotechnology,Ministry of Education,N ingbo University,Ningbo 315211,China)

Utilizing the function of collision energy automatic op timization,the fragmentation patterns of the phospholipids standards,including classes of glycerophosphatidic acid(PA),glycerophosphocholine(PC),glycerophosphoethanolamine(PE),glycerophosphoserine(PS),glycerophosphoglycerol(PG)and glycerophosphoinositol(PI)were studied both in negative and positive modes by triple quadrupole tandem mass spectrometry.It could be inferred that,for all classes of phospholipids,the intensities of the ions arising from neutral loss of the sn-2 substituent as a free fatty acid([M-H-R2COOH]-)or ketene([M-H-R‘2CH=CO]-)are stronger than those of corresponding ions generated byloss of the sn-1 substituent.According to this rule,it was readily to confirm the position of acyl group.In addition,it was easy to elimination of carboxylate substituent from sn-2 position for PC,which meant that the intensity of R2COO-was higher than that of R1COO-.While for PA and PS,the phenomena were totally opposite to that of PC and the intensity of R2COO-was weaker than that of R1COO-.W hen in the positive ion mode,the intensity of acylium ion from the sn-1 position was weaker than the acylium ion from the sn-2 position for PS.Moreover,at low collision energy,for PA and PC species it could be found that the intensities of the ions arising from neutral loss of the sn-2 substituent as a ketene([MH-R’2CH=CO]-)w ere greater than those of ions reflecting corresponding losses of the sn-1 substituent at low collision energy.However,for PE and PG,the intensity of the ion by loss of R1CO2H was stronger than that of ion by elimination of R2CO2H.These fragmentation rules could be used to determine the position of the fatty-acyl substituent of glycerol backbone.

triple quadrupole tandem mass spectrometry;phospholipids;fatty-acyl location

O 657.63

A

1004-2997(2011)04-0200-07

2010-09-25;

2010-12-10

教育部長江學者與創新團隊項目 (IRT0734)、浙江省公益性項目(2010C32G2070011)、浙江省自然科學基金(Y3100534)、寧波市自然科學基金(2009A 610117)資助

蘇小玲(1988～),女(漢族),浙江溫州人,碩士研究生,從事微型藻類的生物化學研究。E-mail:lingluck312@163.com

嚴小軍(1968～),男(漢族),江蘇蘇州人,研究員,從事微型藻類的生物化學研究。E-mail:yanxiaojun@nbu.edu.cn