液相色譜-同位素稀釋質譜法準確測定人血清中葡萄糖含量

申玉星,全 燦,馬 康

(1.廣州市計量檢測技術研究院,廣東廣州 510030;2.中國計量科學研究院化學所,北京 100013)

液相色譜-同位素稀釋質譜法準確測定人血清中葡萄糖含量

申玉星1,全 燦2,馬 康2

(1.廣州市計量檢測技術研究院,廣東廣州 510030;2.中國計量科學研究院化學所,北京 100013)

以D-[13C6]葡萄糖標記物作為內標,用高效液相色譜-串聯質譜法測定血清中的葡萄糖含量。向室溫平衡后的血清樣品中加入葡萄糖標記物,用乙醇沉淀蛋白,低溫離心去除蛋白,上清液過0.22μm有機濾膜。采用LC/MS電噴霧離子源(ESI),正離子模式,選擇離子監測模式進行檢測。方法的線性相關系數R2=0.999 5,加標回收率為100.1%～102.8%,檢出限為8μg/kg,相對標準偏差0.49%。該方法的樣品前處理簡單,測定準確高、精密度好,可用于血清中葡萄糖含量的高準確度定值。

液相色譜-串聯質譜法;同位素稀釋質譜法;血清;葡萄糖

血糖含量測定是臨床檢驗中最重要的指標之一,它可為糖尿病、高血壓以及心腦血管系統等疾病的診斷、療效觀察、病程監測、疾病預防等提供客觀依據[1]。血清葡萄糖常用的檢測方法主要有氧化酶-偶聯比色法、微電流法、氧速率法、己糖激酶法、鄰甲苯胺法、葡萄糖脫氫酶法、微創測定法和同位素稀釋質譜法(IDM S)等[2]。同位素稀釋質譜法是微量、痕量和超痕量物質含量的權威測量方法[3]。測定血清中葡萄糖含量的同位素稀釋質譜法主要是氣相色譜-同位素稀釋質譜(GC-IDM S)法和液相色譜-同位素稀釋質譜(LC-IDM S)法,前者主要通過沉淀去蛋白后衍生化來進行檢測[4-6],樣品前處理過程相對復雜,但較LC-IDM S法的研究更加成熟。文獻報道主要有正離子模式加Na+、Cs+、N H4+[7-9]和負離子模式加 Cl-、I-[10-11]等。LC-IDMS法去除蛋白后可直接進樣檢測,不用衍生化,操作簡單。采用LC-IDM S法對血清葡萄糖含量高準確度定值的研究尚不夠成熟,相關研究報道較少。

本實驗在利用 GC-IDM S法準確測定血糖含量的基礎上[3,6],研究建立LC-IDM S法定量血糖含量。實驗包括配制葡萄糖標準溶液、標記葡萄糖標準溶液以及校準曲線混合溶液,向血清樣品中加入D-[13C6]葡萄糖標記物作為內標,乙醇沉淀蛋白后低溫離心,利用標準曲線計算,通過LC-IDM S儀測定血清中葡萄糖含量。

1 實驗部分

1.1 實驗原理

利用LC-IDM S法測定血清中葡萄糖含量,配制葡萄糖標準溶液、標記葡萄糖標準溶液以及校準曲線混合溶液,向血清樣品中加入D-[13C6]葡萄糖標記物作為內標,利用乙醇沉淀蛋白后低溫離心,取上層清液,過0.22μm有機濾膜進行測定。

1.2 儀器與試劑

1200液相色譜儀,6410串聯三重四極桿質譜儀:美國安捷倫公司產品;Xbridge Am ide色譜柱(3.5μm×4.6 mm ×150 mm):美國 Waters公司產品;M ettler Toledo XP26分析天平(最大感量22 g,d=0.001 mg):瑞士梅特勒公司產品;G-560E渦旋振蕩器(Scientific Industries);3K15離心機(Sigma);0.22μm針筒式微孔濾膜過濾器。

冰凍混合人血清:由軍事醫學科學院野戰輸血研究所提供;D-葡萄糖純度標準品(純度為99.5%):美國Sigma公司產品;D-[13C6]葡萄糖標記物(同位素豐度大于99.9%):英國 Cambridge Isotope Laboratories產品;疊氮化鈉(分析純),乙腈(色譜純):德國 Merck公司產品;無水乙醇(分析純):美國J.T.Baker公司產品;氨水(分析純):汕頭市西隴化工有限公司產品;醋酸銫(純度為99%):Acros Organics;實驗用水為娃哈哈純凈水。

1.3 樣品試樣制備

1.3.1 標準溶液、標記葡萄糖標準溶液配制

由于血清樣品中沒有添加任何抗菌劑,應盡量避免樣品接觸空氣導致微生物引起的葡萄糖含量變化,為此,添加一定體積的0.1%疊氮化鈉溶液有助于血清樣品的長期儲存。精確稱量一定質量的純度標準品,溶入一定體積的疊氮化鈉溶液中,濃度的計算應考慮純度標準品的純度。精確稱量一定質量的標記物純品D-[13C6]葡萄糖溶入一定體積的疊氮化鈉溶液中,標記物溶液在-20℃下冷藏,備用的標記物溶液在4℃冰箱中儲存,該溶液在低溫下可穩定2周。

1.3.2 校準曲線混合溶液配制 根據血清樣品中葡萄糖的大致濃度,用質量法配制。移取100 μL葡萄糖標記物標準溶液(稱質量),分別加入不同體積的葡萄糖標準溶液(稱質量),配制葡萄糖與標記葡萄糖質量比值分別為0.75、0.85、0.95、1.05、1.15、1.25,輕搖混勻、充分平衡 ,分別加入1 m L無水乙醇,渦旋混勻。

1.3.3 血清樣品制備 待血清樣品室溫平衡后,稱取一定質量(100μL)的血清樣品,稱取前輕搖混勻,且于下層吸取防止吸入氣泡。根據血清樣品中葡萄糖的大致濃度,向樣品中加入100 μL葡萄糖標記物標準溶液(稱質量),輕搖平衡。向已添加標記物的樣品中加入1 m L無水乙醇[12],振蕩混勻,在4 ℃下以5 000 r/min離心10 min除去蛋白,取上層清液,過0.22μm有機濾膜。

1.4 回收率及檢出限的測定

取50μL血清樣品,添加50μL葡萄糖標準溶液,加入100μL標記葡萄糖標準溶液后按上述處理方法處理,測定回收率。取一定量葡萄糖標準溶液,用無水乙醇稀釋,制得0.1 mg/kg葡萄糖樣品溶液,以3倍信噪比計算檢出限。

1.5 色譜及質譜條件

1.5.1 色譜條件 1)Xbridge Amide色譜柱:3 μm×2.0 mm×150 mm(Waters);流動相:V(乙腈)∶V(水(0.1%NH4OH))=55∶45的混合溶液;流速 0.4 m L/m in;柱溫 40 ℃。2)Luna amion色譜柱:3.5μm×4.6 mm ×150 mm(Phenomenex);流動相 :V(乙腈) ∶V(水(40 μmol/L Cs+))=80∶20的混合溶液;流速0.2 mL/min;柱溫35℃。3)ZARBOX RX-SIL色譜柱:5μm ×2.1 mm ×150 mm(Agilent);流動相:V(乙腈)∶V(水)=50∶50的混合溶液;流速0.3 m L/min;柱溫40 ℃。4)Xbridge Amide色譜柱:3.5μm×4.6 mm×150 mm(Waters);流動相:V(乙腈)∶V(水)=55∶45的混合溶液;流速0.4 m L/m in;柱溫40 ℃;進樣量5μL。本實驗選擇最優色譜條件4進行血清樣品測定。

1.5.2 質譜條件 電噴霧離子源(ESI),正離子模式,干燥氣溫度 300℃,干燥氣流速 10 L/min,霧化氣壓力 206.7 kPa,毛細管電壓3 500V,碎裂電壓135 V,駐留時間200 m s。

2 結果與討論

2.1 色譜與質譜條件的優化

葡萄糖是右旋糖,屬D構型,在水溶液中主要以呋喃式構型含氧環存在,為α和β兩種構型的衡態混合物。一般用于分離糖類的色譜柱填料,主要為氨基柱或含氨基的聚合物柱,但由于氨基易流失,造成儀器噪聲較高,不利于葡萄糖的檢測。且葡萄糖的兩種構型同時存在,色譜柱分離時易出現雙峰,需提高水相比例或升高溶液的p H值進行改善,但提高水相比例不利于分離。本實驗優化了色譜柱,選擇Xbridge Amide色譜柱,儀器噪聲小,靈敏度高,同時優化了流動相比例。葡萄糖經液相色譜質譜正離子模式檢測時易加成Na+和NH4+,加成 Na+的準分子不易碎裂,具有較高的靈敏度,但會形成少量的[2M+Na]+,示于圖1。提高碎裂電壓至135 V時,可有效降低[2M+Na]+的形成,示于圖2。

選擇加N H4+準分子峰作監測時,一是由于系統中的Na+很難完全去除,干擾加NH4+準分子峰的定量;二是由于一般干燥氣溫度在300℃以上,加NH4+準分子峰易形成較強的脫水峰和脫氨峰,示于圖3。

選擇加Cs+準分子峰作監測時,由于Cs+本身為大離子,對溫度較敏感,不易形成加成物,只有干燥氣在80～100℃時才有較好的信噪比[8],同時也有來自Na+的干擾,示于圖4。本實驗中未考察負離子模式下加Cl-、I-的準分子作為監測離子的條件。

本實驗選擇加Na+準分子作為監測離子,并優化了質譜條件,對血清樣品進行檢測,示于圖5～7。由圖可以看出,葡萄糖標準品和血清樣品中,葡萄糖色譜峰的保留時間為6.1 min,具有較高的靈敏度。

圖1 加標葡萄糖標準品在碎裂電壓為50 V時的質譜圖Fig.1 Mass spectrum of spiked glucose standard in the fragmentor voltage of 50 V

圖2 加標葡萄糖標準品在碎裂電壓為135 V時的質譜圖Fig.2 Mass spectrum of spiked glucose standard in the fragmentor voltage of 135 V

圖3 加標葡萄糖標準品選擇加NH4+準分子峰作監測時的質譜圖Fig.3 Mass spectrum of NH4+attachment

圖4 葡萄糖標準品選擇加Cs+準分子峰作監測時的質譜圖Fig.4 Mass spectrum of Cs+attachment

圖5 加標葡萄糖標準品總離子流色譜圖(a)和加標血清樣品總離子流色譜圖(b)Fig.5 TIC of spiked glucose standard(a)and TIC of spiked serum samples(b)

圖6 加標血清樣品的選擇離子色譜圖Fig.6 SIM of spiked serum samples

圖7 加標血清樣品的質譜圖Fig.7 Mass spectrum of spiked serum samples

2.2 標準曲線、加標回收率及最低檢出限

在葡萄糖標準品與標記葡萄糖標準品質量比為0.75～1.25時,峰面積比和質量比呈良好的線性關系,示于圖8。線性相關系數為R2=0.999 5,加標回收率為100.1%～102.8%。以3倍信噪比作為檢出限,測得此方法的檢出限為8μg/kg。

2.3 血清中葡萄糖含量的測定

取5瓶1#血清樣品進行測定,結果列于表1,取3瓶2#血清樣品,每瓶取2個平行樣,每個樣進 2針,取平均值,結果列于表 2。測得1#、2#血糖濃度分別為1 115.9、1 089.1 mg/kg,相對標準偏差分別為0.47%、0.49%。

表1 1#血清樣品中葡萄糖含量Table 1 Analytical results of serum glucose 1#(n=5)

表2 2#血清樣品中葡萄糖含量Table 2 Analytical results of serum glucose 2#(n=3)

圖8 葡萄糖標準品與標記葡萄糖標準品峰面積比與質量比對應的標準曲線Fig.8 The corresponding standard curve of peak area ratio to themass ratio of standard glucose to labeled glucose standard

3 結論

本實驗利用液相色譜-同位素稀釋質譜法測定血清中葡萄糖的含量,相對標準偏差為0.49%,加標回收率為100.1%～102.8%,檢出限為8μg/kg。該方法樣品前處理簡單,測定準確高、精密度好,可用于血清中葡萄糖含量的高準確度定值。

[1]TH IENPONT L M,STCKL D,De LEENHEER A P.Isotope dilution mass spectrometry and imp lementation of a common accuracy base for routine medical laboratory analysis:Practice and prospects[J].J Mass Spectrom,1995,30:772-774.

[2]戴新華,齊 韜,楊夢瑞,等.血清中葡萄糖含量的測定方法及其研究進展[J].化學分析計量,2008,17(3):78-80.

[3]全 燦,武利慶,戴新華,等.血清中葡萄糖含量CCQM K11-1國際比對[J].化學分析計量,2006,15(4):50-53.

[4]W H ITE V E,WELCH M J,SUN T,et al.The accurate determination of serum glucose by isotope dilution mass spectrometry-two methods[J].Biological Mass Spectrometry,1982,9(9):395-405.

[5]HANNESTAD U,LUNDBLAD A.Accurate and precise isotope dilution mass spectrometry method for determining glucose in w hole blood[J].Clin Chem,1997,43(5):794-800.

[6]丁兆婷,全 燦,金君素,等.氣相色譜-質譜法測定人血清中葡萄糖含量[J].北京化工大學學報:自然科學版,2010,37(2):109-112.

[7]MCINTOSH T S,DAV IS H M,MA TTHEWSD E.A liquid chromatography-mass spectrometry method to measure stable isotopic tracer enrichments of glycerol and glucose in human serum[J].Analytical Biochemistry,2002,300(2):163-169.

[8]ROGA TSKY E,JA YA TILLA KE H,GOSWAM I G,et al.Sensitive LC M S quantitative analysis of carbohydrates by Cs+attachment[J].Journal of the American Society for Mass Spectrometry,2005,16(11):1 805-1 811.

[9]WAN E C H,YU J Z.Determination of sugar compounds in atmospheric aerosols by liquid chromatography combined with positive electrosp ray ionization mass spectrometry[J].Journal of ChromatographyA,2006,1 107(1/2):175-181.

[10]KA TO Y,NUMAJIRI Y.J.Chlo ride attachment negative-ion mass spectra of sugars by combined liquid chromatography and atmospheric p ressure chemical ionization mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B:Biomedical Sciences and Applications,1991,562(1/2):81-97.

[11]ROGA TSKY E,TOM U TA V,STEIN D T.LC/MSquantitative study of glucose by iodine attachment[J].Analytica Chimica Acta,2007,591(2):155-160.

[12]齊 韜,戴新華,楊 屹,等.氣相色譜-質譜分析血清葡萄糖的前處理方法研究[J].分析試驗室,2009,28(2):24-29.

Accurate Determination of Serum Glucose by Liquid Chromatography-Isotope Dilution Mass Spectrometry

SHEN Yu-xing1,QUAN Can2,MA Kang2

(1.Guangzhou Institute of Measuring and Testing Technology,Guangzhou 510030,China;2.Division of Metrology in Chemistry,National Institute of Metrology,Beijing 100013,China)

A high performance liquid chromatography tandem mass spectrometric method w as established for the determination of glucose concentration in serum with the aid of D-[13C6]glucose internal standard.D-[13C6]glucose was added to the serum samp le in balance at room temperature.Then the protein was precipitated and extracted in anhydrous ethanol with centrifugation at low temperature.The supernatant w as filtered through a 0.22μm syringe filter into HPLC vials.Identification was achieved by electro-spray ionization(ESI)in positive mode using SIM mode.The calibration curve of glucose showed good linearity with correlation coefficient ofR2=0.999 5,recoveries of spiked samples were in the range 100.1%to 102.8%,the detection limit of the method was 8μg/kg(S/N=3),and the relative standard derivations were 0.49%.The established method is simple,accurate and precise,is appropriate for the determination of serum glucose with great accuracy.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry;isotope dilution mass spectrometry;serum;glucose

全 燦(1977～),男(漢族),湖南人,博士,副研究員,從事化學計量相關研究。E-mail:superfluidcan@hotmail.com

O 657.63

A

1004-2997(2011)04-0211-05

2010-10-11;

2010-12-21

國家質檢總局食品安全專項(21-ASPAQ1101),國家科技支撐計劃項目(2009BA K61B02),中國計量科學研究院基礎科學研究項目(21-AJDYX1116)資助

申玉星(1981～),男(漢族),山東人,碩士研究生,化學計量專業。E-mail:yxshenoo@163.com