液相色譜-串聯質譜法檢測反應性代謝物

謝 岑,鐘大放,陳笑艷

(中國科學院上海藥物研究所,上海 201203)

液相色譜-串聯質譜法檢測反應性代謝物

謝 岑,鐘大放,陳笑艷

(中國科學院上海藥物研究所,上海 201203)

已有報道一些藥物進入體內后在各種代謝酶的作用下轉化為反應性代謝物,然后與生物大分子(如蛋白、DNA)共價結合,導致毒性。在藥物發現和開發階段進行反應性代謝物篩查,對上市藥物進行反應性代謝物監測已經成為一個重要的研究領域。通常,反應性代謝物具有親電性,能被小分子親核試劑(如谷胱甘肽及其衍生物、氰離子、胺類等)體外捕獲,采用液相色譜-串聯質譜法檢測并鑒定這些結合物的結構是研究反應性代謝物的基本方法。本文綜述了液相色譜與不同質譜儀聯用(三重四極桿、離子阱、四極桿-線性離子阱、高分辨質譜儀)檢測反應性代謝產物的方法以及應用進展。

液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS);反應性代謝物;捕獲試劑

藥物在體內經過生物轉化后,生成的代謝產物大多數極性增加、水溶性提高、藥理活性減弱或完全失活,因此,代謝反應常被認為是生物解毒過程。在某些情況下是經過代謝形成具有親電性的反應性代謝中間體;但在更多情況下是經代謝形成的具有親電性的反應性代謝中間體導致毒性的,它們可通過烷化、酰化與生物大分子(DNA或蛋白質)發生共價結合,導致細胞功能瓦解或激發免疫反應[1]。反應性代謝產物或中間體的生成往往是在藥物代謝酶介導下產生的,稱為生物活化過程。

由于化學不穩定性以及體內存在一些去毒性代謝途徑,藥物代謝過程中生成的高反應性親電代謝物或中間體不易被測出。目前,常使用帶NADPH的肝微粒體以及適當的親核性捕獲劑鑒定反應性代謝產物[2-3],例如谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸、氰離子、氨基脲和甲氧基胺類等。根據與反應性代謝物結合的親核物質類型,可以將反應性代謝物分為“強”親電性代謝物和“弱”親電性代謝物。其中,與含N、O和C親核物質反應的為“強”親電性代謝物,與含S親核試劑反應的為“弱”親電性代謝物[3]。

目前,已有很多關于藥物在CYP450等酶的催化下,在體內形成反應性代謝物而導致藥物毒性的報道[4-9]。如降糖藥曲格列酮、抗抑郁藥萘法唑酮等藥物,被證明產生反應性代謝中間體,與蛋白生成加合物可以導致嚴重的肝毒性,因此先后撤出市場。一些藥用植物成分,如馬兜鈴酸、吡咯里西啶類生物堿、異喹啉類生物堿等,也被證明生成的反應性代謝物導致毒性。在藥物的發現和開發階段進行反應性代謝物篩查,對上市藥物進行反應性代謝物監測已經成為藥物代謝毒理學的重要研究領域。本文將主要介紹液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)法應用于反應性代謝物檢測和鑒定以及應用進展。

1 谷胱甘肽捕獲反應性代謝物

谷胱甘肽(glutathione,GSH)是由3個氨基酸(谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸)組成的小肽,分子中存在1個巰基,可以與反應性代謝中間體的親電基團(如苯醌、苯醌亞胺、Michael受體等)反應,形成穩定的結合物。在正離子掃描模式下,GSH結合物具有相似的質譜裂解規律,示于圖1。通常易中性丟失129 u(焦谷氨酸)產生e型碎片離子,因此,利用中性丟失掃描129 u可以快速檢測 GSH結合物,這是篩選 GSH結合物的傳統方法[10]。但在正離子模式下,中性丟失掃描檢測 GSH結合物的方法主要存在兩方面不足:其一是選擇性差,基質中的許多內源性物質均能產生與GSH結合物無關的129 u中性丟失,因此,在進行復雜生物樣品分析時易出現假陽性結果[11];其二,并非所有 GSH結合物都會產生129 u中性丟失,如在正離子模式下,脂肪族及芐位的硫醚型 GSH結合物通常產生307 u(GSH)中性丟失,而硫酯一般先丟失焦谷氨酸,然后脫去一分子水,即產生147 u中性丟失[12],對于這些類型的結合物,如果只掃描129 u中性丟失就會引入假陰性結果。

為了提高選擇性,減少假陽性結果的產生,可以采用 Q-TOF質譜精確中性丟失掃描129.042 6 u(焦谷氨酸的精確分子質量)以檢測GSH結合物[13]。一般情況,內源性物質會產生與GSH結合物相同理論質量的中性丟失(129 u),但很難產生相同精確質量的中性丟失(129.042 6 u),因此,采用Q-TOF高分辨質譜可以有效減少內源性物質對結果的干擾,從而減少假陽性結果的產生。Q-TOF質譜并不具有真正的中性丟失掃描,而是在兩次不同碰撞能量的全掃描之間來回切換,低能量(5 eV)下獲得前體離子,高能量(20 eV)下獲得產物離子,從而實現“偽”中性丟失掃描。當儀器檢測到能產生129.042 6 u中性丟失的前體離子時,即可對其進行產物離子掃描。與傳統的中性丟失掃描相比,利用Q-TOF質譜進行中性丟失掃描可以提供更高的選擇性,高分辨的碎片離子信息有助于GSH結合物的結構解析,一次進樣的同時采集了前體離子和產物離子,大大縮短了分析時間。

應用穩定同位素標記的GSH作為捕獲劑,可以有效的識別假陽性結果[15-16]。將天然存在的GSH與穩定同位素標記的 GSH(GSX,13C2-15N標記在甘氨酸殘基)等摩爾比混合,以捕獲微粒體孵化液中的反應性代謝物,采用中性丟失掃描129 u進行檢測。GSH/GSX結合物在對應的質譜圖中能產生相差3 u的同位素峰,豐度比為1∶1。采用這種方法檢測對乙酰氨基酚在人肝微粒體中的反應性代謝物,在中性丟失掃描的總離子流圖中主要檢測到3個色譜峰,但僅在1個峰對應的質譜圖中觀察到m/z457/460一對等豐度的同位素峰,因此確定另2個峰為假陽性結果。

為了減少假陰性結果的產生,Dieckhaus等[17]研究各種類型(苯環、芐基、脂肪族和硫酯)的GSH結合物在負離子模式下的二級質譜圖后發現,盡管結合位點和類型不同,但是所有的結合物具有與GSH分子相同的質譜裂解規律,即均能產生響應較強的m/z272碎片離子,示于圖2。因此,可以在負離子模式下對m/z272碎片離子進行前體離子掃描,更全面地篩選各種類型的GSH結合物。通常,GSH結合物在負離子下產生的碎片離子主要來自于 GSH分子,而在正離子下產生的碎片離子主要來自于藥物分子,因此,在正離子模式下獲得的二級質譜圖更有利于結構解析[17]。Wen等[18]利用Q-Trap的正負離子切換功能,在負離子下進行前體離子掃描(m/z272)以作為探測掃描,對于信號強度超過閾值的離子則切換到正離子模式下進行增強的產物離子掃描,以獲得探測掃描所得前體離子的高質量產物離子質譜圖,從而實現高通量篩選和鑒定反應性代謝物。該方法已被成功地應用于多種藥物的反應性代謝物檢測,如對乙酰氨基酚[18]、曲唑酮[19]、阿米替林及其代謝物去甲替林[20]。與中性丟失掃描相比,前體離子掃描(m/z272)表現出更高的靈敏度和選擇性[18]。為了進一步提高檢測靈敏度,并減少假陽性結果,可以同時對m/z272和m/z254(由m/z272碎片離子脫水產生)兩個碎片離子進行雙前體離子掃描[21]。

圖1 谷胱甘肽結合物的特征碎片離子[14]Fig.1 Characteristic fragment ions of glutathione conjugates under collision-induced dissociation[14]

圖2 推測的GSH在負離子模式下的質譜裂解途徑[17]Fig.2 Proposed fragmentation of GSHunder negative mode following collision-induced dissociation[17]

Zheng等[22]開發了一種新型的分析方法,采用多反應監測(MRM)結合增強的產物離子掃描快速篩選和鑒定反應性代謝物。在MRM中,根據可能的 GSH結合物類型設定前體離子,將其中性丟失129 u和307 u后的碎片離子作為監測的產物離子,同時對114對的離子反應進行監測,對其中信號強度超過閾值的離子進行增強的產物離子掃描。采用該方法對若干模型化合物(包括對乙酰氨基酚、雙氯芬酸和卡馬西平的反應性代謝物)進行檢測,結果表明,基于MRM的方法靈敏度比傳統的中性丟失掃描最多可提高179倍,比前體離子掃描提高了10倍。與傳統的中性丟失掃描相比,該方法的選擇性也有較大的提高。例如,采用該方法檢測出卡馬西平在人肝微粒體孵化液中的7種 GSH結合物,而由于受到內源性物質干擾,傳統的中性丟失掃描僅能檢測出其中的2種。然而,這種方法的應用也有局限性,它只能用于檢測常規的可被預測的 GSH結合物,而對那些非常規的結合物,采用中性丟失和前體離子掃描則更有效。

高分辨質譜多數不具備中性丟失、前體離子掃描和MRM功能,這就限制其在檢測復雜基質代謝物中的應用。為了克服這一缺點,Zhang[22]和Zhu等[23]利用代謝物與原形藥物具有相近的質量虧損,開發了質量虧損過濾(mass defect filter,MDF)技術,它屬于數據后處理技術,可用于篩選各種常規和非常規的代謝產物。常見GSH結合物的質量虧損列于表1。對7種模型化合物的肝微粒體孵化液或膽汁中 GSH結合物的檢測表明,該方法具有更高的靈敏度和選擇性,高分辨質譜數據也有助于結合物分子式組成的確定和結構解析[24]。

Zhang等[25]開發了一種新型的數據處理技術,稱為背景扣除法。它是通過比較特定時間段內給藥樣品與對照樣品的高分辨質譜數據,自動識別并扣除與背景相關的信號,從而篩查可能的代謝物相關離子。這種方法被用于雙氯芬酸在人肝微粒體孵化液中反應性代謝物的檢測。色譜圖經背景扣除處理后,共檢測到10種 GSH結合物,而這些結合物在未經處理的色譜圖中是難以觀察到的;同樣,質譜圖經背景扣除處理后,可以清晰地觀察到 GSH結合物的雙電荷離子峰和三電荷離子峰,但在未經處理的質譜圖中,這兩個離子被大量的內源性干擾離子包圍。該方法與MDF技術聯合使用已成功地用于檢測大鼠血漿、膽汁和尿中曲格列酮的反應性代謝物[26]。由此可見,背景扣除法可以有效地檢測各種復雜生物基質中的反應性代謝物,減少內源性物質的干擾,且不需要對代謝物的質量數和質譜裂解途徑進行預判,它對于在離子源中形成的多電荷離子GSH結合物的檢測尤為重要。

表1 在人肝微粒體孵化液中常見反應性代謝物的GSH結合物的質量變化和質量虧損[11]Table 1 Mass shifts and mass defects of GSHadducts of common reactive metabolites formed in human liver microsomes[11]

為了進一步提高選擇性,將天然存在的GSH與穩定同位素標記的 GSX按摩爾比2∶1混合,用于捕獲微粒體孵化液中的反應性代謝物[27]。采用L TQ-Orbitrap質譜檢測,對于能產生特征同位素峰的離子自動進行產物離子掃描;采用MDF、同位素峰分布過濾和背景扣除技術進行數據后處理,能快速、高效地篩選對乙酰氨基酚等藥物的反應性代謝物。

2 谷胱甘肽衍生物捕獲反應性代謝物

通常,為了滿足質譜檢測靈敏度的要求而使用高濃度的底物與肝微粒體共同孵化,但如果化合物的溶解度較差,則不能獲得高濃度的孵化液,這可能導致無法檢測到反應性代謝物。由于GSH結構中含有羧基,會降低正離子檢測的靈敏度,因此以谷胱甘肽乙酯(GSH-EE,圖3a)為捕獲試劑,在正離子模式下可獲得較強的質譜響應;GSH-EE的谷氨酸殘基未發生改變,會產生129 u中性丟失,因此可采用中性丟失掃描129 u進行檢測[28]。實驗表明,GSH-EE結合物的質譜響應比普通的 GSH結合物高了近10倍,對于溶解度差的化合物,即使降低其在孵化體系中的濃度,也不影響反應性代謝產物的檢測。Wen等[29]以 GSH-EE作為捕獲劑,在負離子下進行前體離子掃描(m/z300),再切換到正離子模式下進行增強的產物離子掃描,可以有效地消除肝微粒體中少量內源性GSH結合物的干擾。

γ-谷氨酰半胱氨酰賴氨酸(GSK,圖3b)是一種將GSH中的甘氨酸用賴氨酸替換的新型捕獲試劑,它可以同時篩選“軟”和“硬”反應性代謝產物[30]。由于 GSK結構中保留了谷氨酸殘基,因此其結合物在正離子模式下仍可產生129 u中性丟失。將 GSK與13C6-15N2-GSK(標記在賴氨酸殘基)等摩爾比混合,捕獲反應性代謝物,利用中性丟失掃描129 u,GSK/13C6-15N2-GSK結合物能產生相差8 u的等豐度同位素峰。該方法具有快速、靈敏和可靠的特點,可以在體外篩選不同類型的反應性代謝物。

除 GSH外,N-乙酰半胱氨酸(NAC,圖3c)也可以作為“軟”反應性代謝物的捕獲試劑。在負離子模式下,NAC會產生特征的129 u中性丟失(由NAC硫醚鍵斷裂產生的),因此可通過中性丟失掃描快速篩選NAC結合物,也可根據可能的NAC結合物設定前體離子,將其中性丟失129 u后的碎片離子作為監測的產物離子,同時對多對離子反應進行 MRM檢測[31]。Jian等[32]采用負離子模式下的中性丟失掃描(或MRM)結合正離子模式下的增強產物離子掃描,快速篩查和鑒定了肝微粒體和尿中的NAC結合物。在某些情況下,NAC可代替 GSH作為親核捕獲劑,但當加合反應由谷胱甘肽轉移酶催化(即使是部分催化)時,NAC不再適用。

如上文所述,將 GSH和穩定同位素標記的GSX按一定比例混合作為捕獲劑,通過同位素峰分布過濾的方法可以有效地篩查反應性代謝物。但穩定同位素標記的 GSX較為昂貴,限制了該方法的廣泛使用。因此,LeBlanc[33]設計了一種新型捕獲試劑N-2-溴-芐氧羰基谷胱甘肽(GSH-Br,圖3d),它與反應性代謝物形成的結合物在質譜中會產生相差2 u的等豐度同位素峰,利用同位素峰分布過濾和MDF技術對結果進行篩選,可以提高選擇性,消除假陽性結果。

將谷胱甘肽與熒光基團丹磺酰基反應生成丹磺酰谷胱甘肽(d-GSH,圖 3e),采用 LCFLD-MS/MS法進行測定,可以實現對反應性代謝物的定量分析[34]。d-GSH結合物的最大激發和發射波長分別為340 nm和525 nm。實驗表明,d-GSH和 GSH具有相近的反應活性,但d-GSH不是谷胱甘肽轉移酶的輔酶,所以對篩選需要谷胱甘肽轉移酶催化的化合物不適用。此外,該方法需要較長的色譜運行時間,不能用于高通量篩選。

Soglia[35]報道了以季銨型谷胱甘肽衍生物(QA-GSH,圖 3f)作為捕獲劑,采用 LC-MS/MS法對反應性代謝物進行半定量分析。QAGSH帶1個正電荷,可以增強離子化效率而提高檢測靈敏度,也可以使不同的QA-GSH結合物具有相近的質譜響應。對3種化合物及其QA-GSH結合物的對照品進行質譜分析發現,3種化合物的質譜響應具有19倍的差異,但是結合物對照品的質譜響應差別在3倍以內,表明不同QA-GSH結合物的質譜響應具有均一性。因此,可以用具有對照品的QA-GSH結合物對候選化合物的QA-GSH結合物進行半定量分析,從而評價化合物生物活化水平。通過對不同QA-GSH結合物的二級質譜分析發現,它們均具有相同的m/z144碎片離子,因此以 QAGSH結合物的相對分子質量作為前體離子,以m/z144碎片離子作為監測的產物離子,采用MRM法進行半定量測定,示于圖4。但這種方法存在3點不足:1)只能與“軟”反應性代謝物結合,因此無法對所有的反應性代謝物進行半定量分析;2)不適用于雙QA-GSH或多QA-GSH結合物;3)不適用于需要谷胱甘肽轉移酶催化的化合物。

圖3 各種GSH衍生物的化學結構式Fig.3 Chemical structures of different GSH derivatives

圖4 LC-MS/MS法對 QA-GSH結合物進行半定量分析[35]Fig.4 A semiquantitative method for the determination of QA-GSHconjugate by LC-MS/MS[35]

3 氰離子捕獲反應性代謝物

氰離子(CN-)是一種“硬”親核試劑,可用于捕獲亞胺正離子型反應性代謝物,示于圖5。文獻[36-37]采用 K14CN作為捕獲試劑,檢測并定量亞胺正離子型的反應性代謝物。這種方法雖然選擇性高,但是成本高,限制了它的使用。

正離子模式下,氰基結合物會產生特征的27 u(HCN)中性丟失,因此,可通過中性丟失掃描(27 u)快速篩選氰基結合物[38]。但進行中性丟失掃描(27 u)時發現,許多內源性物質也會產生相同的中性丟失,極易產生假陽性結果。因此,可以采用等摩爾比混合的 KCN和穩定同位素標記的 K13C15N作為捕獲劑,對27 u和29 u(HCN和 H13C15N)進行中性丟失掃描,氰基結合物會產生相差2 u(單加合物)或4 u(雙加合物),且豐度比為1∶1的1對同位素峰[39]。這種方法可以有效地檢測亞胺正離子型的反應性代謝物,目前已廣泛應用于脂環胺類藥物(氯氮平、酮康唑、環丙沙星、噻氯匹啶等)的反應性代謝物研究中[2,39-40]。

4 氨基脲和甲氧基胺捕獲反應性代謝物

圖5 氰離子捕獲亞胺正離子型反應性代謝物[40]Fig.5 Use of cyanide to trap an iminium ion reactive metabolite[40]

有些藥物經代謝活化會生成帶有醛基的反應性代謝物,代謝物可與蛋白上的堿性氨基反應形成希夫氏堿,這種醛型反應性代謝物也可被氨基脲或甲氧基胺等“硬”親核試劑所捕獲。代表性的實驗方法是向孵育體系中加入5 mmol/L氨基脲或甲氧基胺,然后進行 LC-MS/MS分析[2,14,39]。

Zhang等[41-42]以氨基脲和甲氧基胺作為捕獲劑,研究了L-739010和L-746530的生物活化途徑。結果發現,兩個化合物結構中的呋喃環均會在CYP3A酶的催化下開環,形成醛型反應性代謝物,后者可被氨基脲和甲氧基胺捕獲,通過LC-MS/MS分析,鑒定了結合物的結構,從而推測了可能的生物活化途徑,示于圖6。

圖6 采用甲氧基胺或氨基脲捕獲呋喃的醛型反應性代謝物Fig.6 Use of methoxylamine and semicarbazide to trap an aldehyde reactive metabolite

5 反應性代謝物研究舉例

蝙蝠葛堿為一種雙芐基四氫異喹啉類生物堿,含有亞甲基苯酚結構。本實驗室[6]采用LC/MSn法檢測其在人肝微粒體孵化液和SD大鼠膽汁中的反應性代謝物。在人肝微粒體孵化液中共檢測到4種 GSH結合物(M6、M7-1、M7-2和M8,示于圖7),在大鼠膽汁中共檢測到3種GSH結合物(M6、M7-1和M7-2)。為了確定結構,選擇性的進行多級全掃描質譜分析,M6～M8產生的主要中性丟失均為129 u(焦谷氨酸)、273 u(GSH-H2S)和 307 u(GSH)。通過與化學合成的對照品比對,最終確定M6為原形蝙蝠葛堿GSH結合物,M7-1和M7-2為2-N-去甲基蝙蝠葛堿GSH結合物,M8為N-去甲基-O-去甲基蝙蝠葛堿 GSH結合物,GSH均結合在C-17位上。這表明,蝙蝠葛堿的生物活化途徑主要是經代謝酶氧化生成對亞甲基醌型反應性代謝中間體。Zheng等[43]采用CD-1小鼠和人肺細胞株進行毒性研究,發現蝙蝠葛堿可導致嚴重的肺毒性,且與反應性代謝物生成有關。

圖7 蝙蝠葛堿人肝微粒體孵化液中檢測到的 GSH結合物[6]Fig.7 Extracted ion[M+H]+and[M+2H]2+chromatograms of four dauricine-derived GSH conjugates in human liver microsomal incubations[6]

4-壬基苯酚(4-NP)為常見的環境污染物,具有生殖毒性。本實驗室[44]采用 UPLC/QTOF MS法研究了4-NP在人肝微粒體中的生物活化過程。將4-NP與人肝微粒體共同孵化,加入NADPH啟始反應,GSH捕獲反應性代謝物,采用 MDF的 GSH篩查功能處理色譜圖。在孵化體系中共檢測到6種結合物,示于圖8。采用MDF的常規代謝物篩選功能處理色譜圖,在孵化體系中共檢測到19種氧化代謝物。根據獲得的高分辨質譜信息,鑒定了代謝產物的結構,證明4-NP主要有兩種生物活化途徑:其一是4-NP直接氧化為亞甲基醌型反應性中間體;其二是4-NP先經羥基化生成鄰二酚羥基,后者再自氧化形成鄰醌型反應性中間體。

圖8 采用 Q-TOF質譜法和MDF技術檢測到4-壬基苯酚在人肝微粒體中的 GSH結合物[44]Fig.8 Q-TOF MS and MDF analysis of 4-nonylphenol-derived GSH conjugates formed in the human liver microsomal incubations[44]

綠原酸為多種中藥注射劑(雙黃連、清開靈、脈絡寧注射液等)的主要成分之一,本文作者[45]采用UPLC/Q-TOF MS法研究了SD大鼠靜脈注射綠原酸后,膽汁、尿、糞和血漿中可能的代謝產物。采用MDF技術對高分辨質譜數據進行處理,除原形藥物外,共檢測到35種代謝產物,其中,膽汁中19種、尿中18種、糞中12種、血漿中3種,推測的代謝途徑示于圖9。在膽汁中檢測到了多種 GSH結合物,如綠原酸及O-甲基綠原酸的 GSH結合物(M4和M5)和綠原酸水解產物咖啡酸的 GSH結合物(M6),此外,在膽汁及糞中還檢測到了 GSH結合物的次級降解產物O-甲基綠原酸半胱氨酰甘氨酸結合物(M2)和O-甲基綠原酸半胱氨酸結合物(M3)。實驗結果提示,綠原酸的烯酮雙鍵具有很強的親電性,可能與蛋白的巰基共價結合導致過敏性不良反應,該項研究為認識含綠原酸中藥注射劑的過敏性反應機理提供了重要線索。

圖9 推測的大鼠體內綠原酸主要代謝途徑[45]Fig.9 Proposed major metabolic pathways of chlorogenic acid in rats[45]

6 挑戰與展望

檢測反應性代謝物在藥物發現和發展階段越來越受到重視。盡早進行反應性代謝物研究,鑒定易代謝活化的位點,有助于設計新的候選藥物,降低藥物毒性、提高藥物開發的成功率。LC-MS/MS已經成為檢測和鑒定反應性代謝物的重要方法。目前,質譜技術(包括三重四極桿、離子阱、四極桿-線性離子阱、高分辨質譜)的發展、數據處理方法(MDF和背景扣除法)的開發、各種捕獲試劑的應用,極大推動了反應性代謝物的研究,可實現高通量篩選。

然而,由于藥物結合 GSH后,結合物的質譜響應通常與原形差異較大,所以常規的質譜方法無法實現對反應性代謝物的定量測定和該代謝途徑規模的獲知。反應性代謝物最直接的定量方法是通過化學合成對照品或采用放射性標記方法進行定量,但是一般反應性代謝物篩查是在早期的藥物發現階段進行,化學合成對照品或標記化合物周期長且難度大,不能滿足高通量的要求。LC/UV法可以用于 GSH結合物的定量測定,但受到靈敏度的限制[11]。一些新型的捕獲試劑,如連有熒光基團的丹磺酰谷胱甘肽[34]和季銨型谷胱甘肽[35],也被用于反應性代謝物的定量或半定量研究中,但是這些結構修飾是否會影響 GSH的反應活性仍不明確,且 GSH衍生物絕大多數不是谷胱甘肽轉移酶的底物。Valaskovic等[46]利用超低流速的納升噴霧(nanospray)技術,可大致按等摩爾比將代謝物的質譜響應歸一化,從而初步實現對代謝物的定量分析,但這種方法尚未被廣泛地用于反應性代謝物的研究中。總體來說,定量評價反應性代謝物仍面臨極大的挑戰,因此,需要進一步開發新的質譜技術和適用性更廣的捕獲試劑,以實現快速準確定量反應性代謝物。

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Applications of Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry to Detection and Characterization of Reactive Metabolites

XIE Cen,ZHONG Da-fang,CHEN Xiao-yan
(S hanghai Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Sciences,Shanghai201203,China)

A number of therapeutical drugs were reported to undergo metabolic activation by drug-metabolizing enzymes.The bioactivation forms reactive metabolite(s),which readily covalently bind to macromolecules,such as proteins and DNA,and then lead to toxicities.In recent years,screening drug candidates for their tendency to generate reactive metabolites during drug discovery and development process and as well monitoring the bioactivation for post-marketing drugs have become increasingly important.Most reactive metabolites are electrophilic in nature and can react with nucleophiles.In vitro microsomal incubations,small nucleophilic molecules,such as glutathione,cyanide and amines are generally used to trap reactive metabolites.Structural elucidation of these stable adducts are conducted by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.In this review,different mass spectrometers including triple quadrupole,ion trap,quadrupole-linear ion trap,and high-resolution mass spectrometer,employed for assessing reactive metabolites are described.The recent advances of different techniques and approaches are also discussed.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS);reactive metabolites;trapping agents

陳笑艷(1971～),女,黑龍江人,研究員,從事藥物代謝與藥物動力學研究。E-mail:xychen@mail.shcnc.ac.cn

O 657.63

A

1004-2997(2011)01-0001-12

2010-12-14;

2010-12-27

國家自然科學基金項目(30873119)資助

謝 岑(1985～),女,浙江人,博士研究生,從事藥物代謝與藥物動力學研究。E-mail:carolxc@hotmail.com