睡眠剝奪對大鼠學習記憶、海馬IL-1β表達的影響及SB203580干預作用

趙雅寧，李建民，陳長香，李淑杏

（河北聯合大學康復醫學系，河北 唐山 063000）

睡眠剝奪對大鼠學習記憶、海馬IL-1β表達的影響及SB203580干預作用

趙雅寧，李建民，陳長香，李淑杏

（河北聯合大學康復醫學系，河北 唐山 063000）

目的睡眠剝奪（SD）對大鼠學習記憶、海馬IL-1β表達的影響及SB203580干預作用。方法 90只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分成對照組、模型組、SB203580干預組。改良多平臺法建立SD模型。光鏡觀察海馬區神經細胞形態變化，免疫組化法和Western blot法檢測海馬區IL-1β蛋白的表達，水迷宮法測試動物學習記憶功能。結果 與對照組比較，模型組中，隨睡眠剝奪時間延長，SD大鼠海馬神經元結構損傷明顯，存活神經元密度降低、IL-1β陽性細胞數及表達增多，動物學習記憶能力減退；與模型組比較，SB203580組中腦組織形態損傷程度減輕、存活神經元密度增加、IL-1β表達回降，動物學習記憶功能得到改善。結論SD可增加海馬IL-1β表達，引起動物認知功能障礙，SB203580可能通過降低海馬IL-1β表達，改善SD大鼠學習記憶功能。

睡眠剝奪；白細胞介素1；學習記憶

睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）是指由于各種原因引起的睡眠丟失狀態。隨著生活節奏的加快，社會壓力的增大等，睡眠剝奪已成為現代社會的普遍現象，是睡眠醫學所關注的主要研究內容之一。來自臨床的資料顯示，睡眠剝奪可導致學習記憶能力下降、注意力分散、定向障礙等認知功能改變［1］。細胞因子白細胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）是中樞神經和免疫系統相互作用的關鍵信使之一，其不僅調節中樞神經系統的諸多生理活動，并廣泛參與中樞神經系統疾病如Alzheimer's病（AD）、腦卒中的病理生理過程［2］。但IL-1β與SD導致的學習記憶障礙是否有關尚不清楚。本實驗通過觀察不同睡眠剝奪時間對大鼠海馬IL-1β表達的影響，探討IL-1β在睡眠剝奪（SD）大鼠認知障礙中的作用；同時本研究引入p38MAPK信號抑制劑SB203580，對SD后IL-1β表達的信號做初步的探討。

1 材料與方法

1.1 動物分組和模型制備

雄性SD大鼠90只（北京維通利華公司，合格證：SCXK（京）2002-003），體質量（330±20）g，隨機分為對照組（30只）、模型組（30只）和SB203580干預組（30只），每組平均分為SD1d、3d、5d 3個亞組。

采用改良多平臺法制備異相睡眠剝奪模型。睡眠剝奪箱大小為30cm×30cm×150cm，中央放置一直徑為6cm，高8cm的平臺。剝奪箱內注有水，水面低于平臺2cm水溫保持在（20±2）℃。大鼠可在平臺上進入睡眠時，由于骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而驚醒，造成睡眠剝奪。對照組除平臺增大為直徑13cm，其余因素與SD組一致，大鼠在大平臺上進入睡眠。SB203580干預組的實驗條件，造模前30min經尾靜脈靜脈注射，劑量0.5μg/kg，以后，每隔24h注射一次，連續給藥5d。

1.2 腦組織形態結構觀察（HE染色）

各組動物在規定時間點0.4%戊巴比妥納麻醉動物，開胸、暴露心臟，4%多聚甲醛行心臟灌流，斷頭取腦，在視交叉處冠狀面切開，取中間塊入4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，切片（片厚5μm），進行HE染色。每只鼠連續3張冠狀背側海馬切片，采用圖像分析儀（美國Bio-Rad公司）計數正常神經元，取均值。

1.3 IL-1β免疫組化

切片常規脫蠟至水，參照試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）說明進行免疫組化染色。陽性率的定量分析：每個標本取4張切片，400倍光鏡下每張切片在海馬隨機選取4個視野，用計算機圖像分析系統（Bio-Rad）對各組陽性細胞進行吸光度（absorbance，A）分析。

1.4 免疫印跡法測定海馬區IL-1β

脫頸法處死大鼠，斷頭取腦，分離海馬，加入裂解液，冰浴中勻漿，4℃離心 5min，3000r/min，取上清，考馬斯亮藍法蛋白質定量，樣品制備，轉膜、加入抗體（IL-1β，1∶1500；β-actin，1∶1000）、封閉、ECL 顯色。Bio-Rad系統進行吸光度測定，以目的條帶與內參照β-actin的平均吸光度的比值表示蛋白水平，進行半定量分析。

1.5 學習和記憶功能檢測

按照Smith等［3］的方法，采用Morris水迷宮進行檢測，上午、下午各一次，記錄各組大鼠搜索安全島（即平臺）潛伏期時間（單位時間：s）；和撤去平臺后動物穿越原平臺位置的次數，取檢測記錄的總均值。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 病理結果

對照組海馬神經細胞形態結構正常，排列整齊致密；模型組中，SD 1d海馬神經元出現形態結構改變，表現為細胞水腫，隨時間延長至3d、5d，細胞結構損傷時，視野內可見壞死改變的神經細胞，表現為細胞周圍空隙增寬、胞核皺縮濃染等，存活神經元密度明顯減少（P<0.05）；SB203580干預組存活神經元密度均增加（P<0.05）。（表 1、圖 1）。

表1各組海馬區的神經元密度比較（n=15，±s）T a b.1C o mp a r i s o n o f n e u r o n d e n s i t y i n h i p p o c a mp a l r e g i o n（n=15，±s）Group 1d 3d 5d Control group 26.33±4.27 26.53±4.56 25.93±4.17Model group 20.15±3.901） 18.85±3.781） 13.52±2.681）SB203580group 23.93±3.572） 22.86±3.572） 23.03±3.882）1）compared with control group，P ＜ 0.05；2）compared with model group，P ＜ 0.05.

2.2 IL-1β免疫組化和免疫印跡結果

免疫組化結果顯示IL-1β陽性表達主要位于細胞漿。陽性細胞的胞質可見細小的棕黃色顆粒。對照組大鼠海馬區只有極少量的陽性細胞，染色較淡。SD后1d、3d、5d IL-1β陽性細胞呈不同程度增加，染色棕黃，陽性細胞主要分布在海馬易敏感區CA1區、其次在CA2、CA3區，齒狀回也有少量有分布；SB203580組中IL-1β陽性細胞減少，染色變淡。免疫印跡定量結果顯示，與對照組比較，模型組中IL-1β蛋白水平在相應時間點明顯上調，SD5d達高峰（P<0.05）；SB20358干預組中IL-1β蛋白水平下降（P<0.05）。（表 2、圖 2）。

表2各組I L-1β蛋白表達水平比較（±s）T a b.2C o mp a r i s o n o f I L-1β e x p r e s s i o n i n e a c h g r o u p（±s）Group 1d 3d 5d Control group 0.40±0.17 0.52±0.15 0.48±0.12Model group 3.56±1.191） 4.60±1.291） 7.68±2.561）SB203580group 1.58±0.472） 1.88±0.492） 4.45±1.232）1）compared with control group，P ＜ 0.05；2）compared with model group，P ＜ 0.05.表3各組大鼠水迷宮檢測結果（±s）T a b.3Mo r r i s w a t e r ma z e i n e a c h g r o u p（±s）Groups Latency to find the platform Time of passing the platform 1d 3d 5d 1d 3d 5d Control group 55.5±7.5 54.7±6.3 55.8±6.5 8.20±1.52 8.25±1.62 8.31±1.58Model group 92.5±21.81） 105.6±24.51） 120.8±28.01） 5.08±1.111） 4.25±1.221） 2.28±1.001）SB203580group 62.0±16.72） 70.5±20.72） 84.8±22.82） 6.98±1.322） 5.68±1.122） 4.17±1.152）1）compared with control group，P ＜ 0.05；2）compared with model group，P ＜ 0.05.

2.3 學習記憶功能結果

與對照組比較，模型組大鼠搜索安全島潛伏期明顯延長、穿越原平臺位置的次數減少（P＜0.05）；SB20358干預可縮短大鼠搜索安全島潛伏期時間、增多穿越原平臺位置的次數（P＜0.05，表3）。

3 討論

睡眠是人類日常生活中的必要組成部分，不僅涉及體溫調節、免疫功能的維持等，亦能促進記憶的鞏固，使其轉化成更加穩定的狀態。有數據顯示，剝奪睡眠超過24h，可導致人認知能力下降30%～70%［1］。近年來，國內外學者開展了睡眠剝奪對認知功能的影響，但相關機制尚需深入研究。

中樞神經系統IL-1β生物功能與其濃度有關。生理情況下，IL-1參與中樞神經系統的免疫調節、促進神經元的生長發育以及記憶等。而當腦受到缺氧、缺血刺激時，IL-1β異常升高，高濃度IL-1β可抑制海馬部位神經元的興奮性和突觸功能從而導致認知功能障礙［4］。MaAfoose等［5］認為高濃度 IL-1β 可直接影響長時程增強（LTP）或神經的發生引起學習記憶缺陷。本研究觀察與認知功能密切區域-海馬區IL-1β表達，結果發現隨睡眠剝奪時間延長，模型組中海馬區IL-1β較對照組表達明顯增高；結果還顯示隨睡眠剝奪時間延長，模型組中動物搜索安全島潛伏期與穿越原平臺位置的次數較對照組差異顯著，說明睡眠剝奪能使IL-1β表達增多。推測睡眠剝奪后，腦組織氧化應激反應增強，相對敏感性較強的海馬區IL-1β表達增高，從而引起動物學習和記憶功能受損。

實驗證實，IL-1β主要通過p38有絲分裂原活化 蛋 白 激 酶 （mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號途徑參與多種疾病如腦卒中、AD病等病理過程［6，7］。即 p38MAPK 活性越強，IL-1β 表達越高，同時高濃度的IL-1β可進一步增加p38MAPK信號活性。研究顯示P38MAMPK對腦損傷后的神經功能起負性調節作用［8，9］。本研究，應用 p38MAPK 蛋白特異性抑制劑SB203580進行干預，初步探討p38MAPK與睡眠剝奪認知功能、IL-1β之間的關系。結果顯示：與模型組比較，SB203580干預組中動物學習記憶功能得到改善、海馬區神經元存活密度增加、IL-1β表達，提示p38MAPK信號途徑和IL-1β可能是睡眠剝奪認知功能障礙重要機制之一，睡眠剝奪可能通過影響p38MAPK/IL-1β信號轉導途徑，進而損害機體的學習記憶功能；而SB203580通過抑制SD后p38MAPK信號通路活化級聯反應，下調IL-1β表達，最終促進了學習記憶功能的恢復。有關SD后p38MAPK信號活化的具體機制尚需深入研究。

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（編輯孫憲民，英文編輯鄭華川）

Effect of Sleep Deprivation on Learning-memory and Hippocampal IL-1β in Rats and the Role of SB203580Intervention

ZHAO Ya-ning，LI Jian-min，CHEN Chang-xiang，LI Shu-xing
（Department of Rehabilitation Medicine for Hebei United university，Tangshan 063000，China）

ObjectiveTo investigate the effects of sleep deprivation （SD）on learning-memory and hippocampal IL-1β in Rats and the role of SB203580intervention.MethodsMale Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups：control，model，SB203580-treated groups.SD models were established by the modified multiple platform methods.Morphological changes were observed with light microscopy.The IL-1β expression was examined by immunohistochemistry and Western blot.Learning and memory function was monitored with Morris water maze.ResultsCompared with control group，neuronal structure was obviously damaged，the density of survival neurons decreased，the IL-1β expression increased and learning and memory function significantly decreased with time of SD in model group.Compared with model group，the density of survival neurons was increased，IL-1β expression obviously decreased，but the ability of learning and memory function enhanced in SB203580-treated group（P ＜ 0.05）.Conclusions SD could increase IL-1β expression and finally result in cognition injury.However，SB203580improved learning-memory function by attenuating IL-1β expression.

sleep deprivation；interleukin-1β；learning-memory

R338.6

A

0258-4646（2011）01-0030-04

河北省科技廳支撐項目（2009276103D-7）

趙雅寧（1974-），女，副教授，碩士.

李建民，E-mail：lijianmints@sina.com

2010-09-09