乳腺導管內增生性病變p53外顯子突變的研究

毛曉韻，范垂鋒，魏晶，劉崇，姚凡，金鋒

（1.中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤外科，普通外科教研室，乳腺外科，沈陽 110001；2.中國醫科大學基礎醫學院病理學教研室，沈陽110001）

乳腺導管內增生性病變p53外顯子突變的研究

毛曉韻1，范垂鋒2，魏晶1，劉崇1，姚凡1，金鋒1

（1.中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤外科，普通外科教研室，乳腺外科，沈陽 110001；2.中國醫科大學基礎醫學院病理學教研室，沈陽110001）

目的腫瘤抑制基因p53突變是浸潤性乳腺癌發生發展中常見事件，而其與包括普通型增生（UDH），不典型增生（ADH）及導管內原位癌（DCIS）的乳腺導管內增生性病變關系不明。探討p53在乳腺導管內增生性病變的外顯子突變情況，以期了解p53突變在乳腺癌發生發展中的作用。方法 用高分辨率熔解曲線和測序研究122例乳腺導管內增生性病變中p53外顯子5～8的突變情況。結果 經HRM篩選，14例患者DNA熔解曲線與野生型標準品熔解曲線大于閾值，經測序分析，其中13例出現p53外顯子突變。35例UDH中均未發現突變，10.7%（6/56）ADH和22.6%（7/31）DCIS發現至少1個位點的點突變，其中1例DCIS發現2個位點的突變。結論p53突變發生于乳腺導管內增生性病變中的ADH與DCIS，其可能為乳腺癌發生發展中的早期事件。

乳腺導管內增生性病變；p53突變；高分辨率熔解；DNA測序

p53基因是迄今發現與人類腫瘤相關性最高的基因，突變型p53蛋白表達對乳腺癌的臨床分期和預后產生負性影響［1］。乳腺導管內增生性病變是一組形態學結構復雜多樣、與乳腺癌關系十分密切的病變［2］。其主要發生于終末導管小葉單位，少數發生于大導管和輸乳管，包括普通型導管增生（usual ductal hyperplasia，UDH）、非典型導管增生（atypical ductal hyperplasia，ADH）和導管原位癌（ductal carcinoma in situ，DCIS），與發生浸潤性乳腺癌的危險性相關［3］。目前，有關p53與乳腺導管內增生性病變，特別是與乳腺導管內非典型增生病變相關性的研究報道較少，其在中國人群突變情況未見報道。高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）技術是近年來在傳統突變檢測方法的基礎上發展起來的一種用于突變掃描和基因分型的新技術，其原理在于熔解曲線的變化取決于擴增產物的序列、長度和堿基組成，通過熔解曲線的變化反映核酸性質的差異，是應用熔解曲線對突變位點進行檢測的新方法［4，5］。以前大量研究表明，95%的p53突變發生于高度保守的外顯子5～8區域，且在所有p53突變形式中，常見的是因點突變引起的錯義突變，而缺失或插入突變都是較少發生的［8］。在本研究中，我們通過HRM和基因測序研究p53外顯子5～8在乳腺導管內增生性病變中的突變，以期了解其在乳腺癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集中國醫科大學附屬第一醫院乳腺外科2007年6月至2009年10月女性新鮮不伴癌的乳腺導管內增生性病變標本122例（UDH35例，ADH 56例，DCIS 31例），年齡18～72歲，中位年齡37.6歲。患者術前均未經放化療，其病理經2位病理醫生按世界衛生組織（WHO）《乳腺病理組織學分類》（2003新版）標準讀片確認其病理類型，-80℃保存。

1.2 DNA提取

每例均經冰凍切片HE染色，確認病理類型和定位，用酚氯仿法提取乳腺導管內增生性病變組織DNA，用NanoDrop 1000紫外分光光度計測定核酸質量及濃度，并全部標準化為10ng/μl。

1.3 HRM檢測

p53基因第5、6、7和8外顯子HRM PCR引物及產物長度見表1。20μl HRM PCR反應體系含10ng基因組 DNA，上下游引物各 20μmol，MgCl21.5mmol，2×Light Cycler誖 480High Resolution Master Mix（羅氏公司，德國）10μl，以野生型標準品為陽性對照。加樣完成后，使用Roche專用貼膜將96孔PCR反應板封住，液體充分混勻后置Roche Lightcycler 480中檢測。PCR循環條件為94℃變性15min，然后進入94℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸25s循環，循環45次，最后72℃延伸5min。HRM 過程：95℃ 1min，40℃ 1min，65℃ 1s，再以每秒1℃的速度從65℃升至95℃，Light Cycler誖480系統特有的基因掃描軟件于升溫過程中每度檢測40次熒光，計算出熔解曲線圖。

表1p 53外顯子引物及P C R產物長度T a b.1p 53p r i me r s a n d P C Rp r o d u c t s i z e Exon Sequence（5'→3'） Size（bp）5 Fwd：TTCCTCTTCCTGCAGTACTC Rev：CAGCTGCTCACCATCGCTAT 6 Fwd：CACTGATTGCTCTTAGGTCT Rev：AGTTGCAAACCAGACCTCAG 7 Fwd：GTGTTATCTCCTAGGTTGGC Rev：CAAGTGGCTCCTGACCTGGA 8 Fwd：CCTATCCTGAGTAGTGGTAA Rev：TCCTGCTTGCTTACCTCGCT 210144144165

1.4 HRM產物的測序分析

用相應引物擴增、純化和回收通過HRM篩出的突變樣品，置ABI 3730測序儀測序（上海生工公司）。

2 結果

經HRM分析，共14例患者DNA熔解曲線與野生型標準品熔解曲線大于閾值，結合測序分析結果發現，其中13例出現p53外顯子突變（圖1，2，表2）。35例 UDH 中均未發現突變，10.7%（6/56）ADH和22.6%（7/31）DCIS發現至少1個位點的點突變，其中1例DCIS發現2個位點的突變。突變位點依據國際公共p53突變數據庫（The universal mutation p53database，UMDp53database，http：//p53.free.fr/）查出其在人類腫瘤的突變頻率。在所發現的14個p53突變位點中，有2例突變位于第五外顯子，3例突變位于第6外顯子，4例突變位于第7外顯子，5例突變位于第8外顯子。

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3 討論

以往檢測致病突變的主要方法有PCR-等位基因特異性寡核苷酸探針、PCR-測序、PCR-單鏈構象多態性、PCR-限制性片段長度多態性等，以上方法不僅費用高，而且費時費力，無法開展致病基因的大規模突變篩查［6］。HRM利用PCR后擴增子的核苷酸序列和長度不同而引起的各堿基含量的差異，通過不同溫度下實時檢測升溫過程的熔解曲線來反映DNA鏈中單個或多個位點的基因變化。可以說，核苷酸的排列和配對堿基不同是其熔解溫度產生差異的根本原因。HRM通過這種實時檢測技術，判斷升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴增產物的結合情況，進行p53突變的初篩。有研究用HRM及測序方法對比研究了47個樣本中p53的突變情況，發現HRM的敏感性達到1.0，特異性達到0.83［7］，我們研究中發現HRM篩出14位點的p53突變，測序結果表明其中13個為錯義突變，1個未出現突變，特異性高。且其不受堿基突變位點和種類的局限，其不僅能夠對已知突變進行分析，對未知突變的篩查、掃描和短片段重復序列的分析也有理想的檢測效果。其還能縮短操作時間，簡化操作步驟，大大降低使用成本，并且實現真正的閉管操作，最大限度地避免交叉污染。

腫瘤抑制基因p53在細胞周期調控、DNA修復、細胞分化、細胞凋亡等過程中都起著重要的作用。p53基因突變是目前所知人體腫瘤最常見的基因改變，在許多腫瘤的發病過程中起重要作用，該基因突變對乳腺癌的臨床分期和預后產生負性影響。乳腺導管內增生性病變主要發生于終末導管小葉單位，少數發生于大導管和輸乳管，與發生浸潤性乳腺癌的危險性相關。長期隨訪發現，UDH是正常人的1.5倍，ADH為4～5倍，DCIS為8～10倍。普通型導管增生是一種以成二級管腔和中央增生細胞呈水流樣分布為特征的良性導管增生，WHO工作小組認為UDH不是一種有意義的乳腺癌危險因素。Allred等［9］認為UDH沒有p53基因突變和p53蛋白表達，除非是出現在Li-Fraumeni患者的遺傳性突變。我們研究發現10.7%的乳腺導管內增生性病變存在p53突變，在所研究的35例UDH中均未發現p53突變，這與Allred等［9］的觀點吻合。近期一項比較基因組雜交研究提示，UDH中的一部分可以是ADH的前驅病變。ADH是一種以分布均勻的單形細胞增生為特征的腫瘤性導管內病變，進展為浸潤性乳腺癌的危險性為中度。DCIS也是一種腫瘤性導管內病變，其特征為導管上皮細胞呈顯著增生，伴輕微至明顯的異型性，有發展為浸潤性乳腺癌的傾向。目前關于在ADH病變中p53突變的觀點有爭議。Done等［10］用PCR-SSCP在21例乳腺增生性病變中均未發現p53突變，其中包括1例ADH，其認為p53突變出現于DCIS階段。Keohavong等［11］檢測了6例DCIS和10例ADH的p53突變，發現在其中3例DCIS和5例ADH中存在p53突變，認為p53突變不僅出現于DCIS，也出現于ADH等。我們發現10.7%（6/56）ADH和22.6%（7/31）DCIS至少存在 1個位點的點突變，其中1例DCIS發現2個位點的突變，提示p53突變參與了乳腺癌的發生發展，且其可能為惡性腫瘤轉化的早期事件。我們在ADH和DCIS中發現的p53突變位點及點突變類型在UMDp53突變數據庫中均能找到，且出現了突變頻率很高的幾處突變類型（R175H，A273C，R248Q），這些點突變與p53蛋白結構與功能改變密切相關。p53基因突變在乳腺癌發生發展中的作用及意義，還需要我們進一步擴大樣本量，追蹤隨訪來驗證和完善。

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［11］Keohavong P，Gao WM，Mady HH，et al.Analysis of p53mutations in cells taken from paraffin-embedded tissue sections of ductal carcinoma in situ and atypical ductal hyperplasia of the breast［J］.Can Lett，2004，212（1）：121-130.

（編輯裘孝琦，英文編輯鄭華川）

Mutation ofp53Exon in Breast Intraductal Proliferative Lesions

MAO Xiao-yun1，FAN Chui-feng2，WEI Jing1，LIU Chong1，YAO Fan1，JIN Feng1
（1.Department of Surgical Oncology，Research Unit of General Surgery，Department of Breast Surgery，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Pathology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveAlthoughp53mutation is one of the most common alterations identified in invasive breast carcinomas，it is not clear whether its alteration frequently occurs in intraductal proliferative lesions including usual ductal hyperplasia（UDH），atypical ductal hyperplasia（ADH）and ductal carcinoma in situ（DCIS）.The aim of this study is to investigate thep53mutation in intraductal proliferative lesions，and clarify its significance in breast carcinogenesis.Methodsp53mutation was examined in 122cases of noninvasive breast lesions including UDH，ADH and DCIS by high-resolution melting（HRM），followed by DNA sequence.ResultsThe positive rates ofp53mutation were 0.0%，10.7%and 22.6%in UDH，ADH and DCIS，respectively.Conclusionp53mutation occurs in intraductal proliferative lesions including ADH and DCIS，and might be an early event in breast carcinogenesis.

intraductal proliferative lesions；p53mutation；high-resolution melting；DNA sequence analysis

R737．3

A

0258-4646（2011）01-0060-04

國家自然科學基金資助項目（30950009）

毛曉韻（1979-），女，住院醫師，博士.

金鋒，E-mail：jinfeng66cn@hotmail.com

2010-10-05