鳡β-肌動蛋白基因的克隆及表達分析

郁建鋒，王 蕾，張燕萍，李建林，顧志良

（1.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心 農業部淡水魚類遺傳育種和養殖生物學重點實驗室，江蘇 無錫 214081；2.常熟理工學院 生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

肌動蛋白（actin）在維持細胞結構、細胞運動和細胞分裂等過程中發揮著重要的作用.為了克隆鳡(Elopichthys bambusa)β-肌動蛋白(β-actin)全長cDNA，采用反轉錄PCR（RT-PCR）和cDNA末端快速擴增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術，從鳡肌肉獲得全長為1775bp的β-ac?tin cDNA序列，其中包含1128bp的開放性閱讀框，編碼375個氨基酸，5′-非翻譯（UTR）區為98個核苷酸，3′-UTR區為549個核苷酸.核苷酸與氨基酸的同源性分析發現，鳡β-actin與鯉形目類硬骨魚的同源性均在98%以上，其中與團頭魴（Megalobrama amblycephala）的同源性最高，分別為98.94%和99.73%，而與其他脊椎類動物如哺乳類、鳥類、兩棲類的同源性也分別在85%和97%以上，說明該基因在生物的分子進化過程中具有很高的保守性.采用核苷酸系統發育分析結果顯示鳡β-actin與鯉形目類硬骨魚聚類在一起，且與團頭魴的親緣關系最近.RT-PCR分析結果顯示，β-actin基因在鳡的肝臟、腎、腸、腦、心臟、鰓和肌肉等7個組織均有表達.

鳡；β肌動蛋白；克隆；表達

肌動蛋白(actin)是構成真核生物細胞骨架和肌小節的主要成分，在細胞生理活動方面，如維持細胞結構、細胞運動和細胞分裂等過程中發揮著重要的作用[1,2].脊椎動物細胞肌動蛋白由多個基因組成的家族所編碼，一般由375～377個氨基酸殘基組成，有6種異構體，分為α、β、γ三類：兩個橫紋肌（α-骨骼肌型，α-心肌型），兩個平滑肌（α-血管平滑肌型，γ內臟平滑肌型），兩個細胞質型（β和γ亞型）[3].在物種間，肌動蛋白的氨基酸同源性可高達70%以上，其中β-actin蛋白質的氨基酸尤為保守，軟體類、節肢類、魚類、兩棲類、鳥類、哺乳類等不同類群動物的β-actin蛋白質氨基酸同源性均在96%以上[4]，甚至在有些物種中如原雞、鼠和人的β-actin蛋白質氨基酸同源性可達100%[5].包括硬骨魚類在內的動物的β-actin基因已被大量克隆，其也成為物種進化分類研究中的一個重要標志.β-actin mRNA的表達水平較高，且和其他管家基因一樣為恒量表達，因此在測定其他基因mRNA的表達情況時，可以β-actin mRNA作為內標[6]．

鳡屬鯉形目，鯉科，雅羅魚亞科，鳡屬，為江河、湖泊中大型經濟魚類之一.由于過去將鳡作為“害魚”的清除和近年來隨著自然環境的惡化、捕撈強度的增大等因素，鳡資源遭到了嚴重的破壞，種群數量急劇下降，已被列入國家重點保護瀕危及受威脅水生物種名錄[7].鳡β-actin基因的研究還未見報道，克隆鳡β-actin基因旨為其在鳡中的生物學功能研究及進行其他基因的量化研究提供可靠內參的基礎數據，提高內參引物設計的正確性和特異性，同時也為揭示物種進化提供了新信息．

1 材料與方法

1.1 實驗動物及總RNA提取

鳡由江蘇省蘇州市水產工程中心提供，魚齡為3個月，取其肌肉、腦、肝臟、心臟、鰓、腸和腎臟等7個組織，采用RNAiso Reagent（TaKaRa）分別提取上述組織的總RNA，并用DnaseⅠ處理純化后保存于-80℃．

1.2 鳡β-actin部分編碼序列的擴增

按反轉錄試劑盒（TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0.）要求進行反轉錄反應，反應體系：2μL MgCl2(25mmol/ L)，1μL10×RT Buffer，1μL dNTP Mixture（10mmol/L each），0.25μL RNase Inhibitor，0.5μL AMV Reverse Transcriptase，0.5μL Random 9 mers，1μg總RNA，加RNase Free dH2O至總反應體積為10μL.反應條件：30℃×10min；42℃×30min；99℃×5min；5℃×5min.根據斑馬魚（Danio rerio）（AF057040.1）、和鯉魚（Com?mon carp）（M24113.1）設計β-actin保守區段特異性引物為BactinF：5′-ccagatcatgttcgagaccttc-3′和BactinR：5′-gaacctctcattgccaatggtg-3′.用于擴增鳡β-actin cDNA的部分序列，反應體系：10×PCR buffer 2.5μL，10 mmol/L dNTP Mixture 2μL(2.5mmol/L each)，10μmol/L引物BactinF/BactinR各1μL，rTaq（5U/μL）1μL，1 μL cDNA，dd H2O 17.3μL；PCR程序：94℃預變性3min；94℃×30sec，58℃×30sec，72℃×45sec，共35個循環；72℃延伸8min.擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，膠回收目的片段，并克隆入pMD18-T后測序（上海桑尼生物公司測序）．

1.3 RACE擴增鳡β-actin的mRNA的5′端和3′端序列

根據獲得的部分鳡β-actin基因序列設計用于5′-RACE和3′-RACE的特異性引物：Bactin5'in（5'-cacatagcagagcttctcct-3'）、Bactin3'in（5'-gtgacctgactgactacctc-3'），引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成.引物 3′race outer primer（5′-taccgtcgttccactagtgattt-3′）、3′race inner primer（5′-cgcggatcctccactagtgatttcactatagg-3′）、5′race outer primer（5′-catggctacatgctgacagccta-3′）、5′race inner primer（5′-cgcggatccacagcctactgatgatcagtcgatg-3′）分別來自于TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0和5′-Full RACE Kit試劑盒．

5′-RACE按TaKaRa 5′-Full RACE試劑盒程序進行.將制備好的cDNA用5′race outer primer/BactinR進行第一輪擴增，再以5′race inner primer/Bactin5′in引物對第一輪的PCR產物進行巢式PCR.PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收克隆入pMD18-T后測序．

3′-RACE按TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒程序進行.用引物BactinF/3′race outer primer對制備的cDNA進行第一輪擴增，然后用引物Bactin3'in/3′race inner primer進行第二輪巢式PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收克隆入pMD18-T后測序．

1.4 序列分析

應用BLAST工具將獲得的鳡β-actin基因的cDNA在網上進行同源性比對分析，并推斷其開放閱讀框和編碼氨基酸的序列情況.將獲得的序列在DNAMAN5.0軟件上進行分析，進行物種間同源性比較.利用MEGA 4.1軟件中的Kimura 2-parameter法計算凈遺傳距離矩陣.以距離矩陣鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）建系統發生樹，通過自引導檢驗(bootstrap)獲得系統分支的置信度(重復次數為1000)．

1.5 鳡β-actin的組織表達檢測

RT-PCR方法檢測不同組織β-actin mRNA的表達分布，方法按反轉錄試劑盒（TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0）程序進行.PCR反應體系和條件：0.2μL rTaq聚合酶(5U/μL)(TaKaRa)，2.5μL 10×PCR Buffer(without Mg2+)，2μL dNTP(2.5mmol/L each)，1.5μL MgCl2（25mmol/L），引物BactinF和BactinR各1μL(10pmol/L)，1μ L cDNA，加滅菌dH2O至25μL.PCR擴增條件：95℃預變性5min；然后在95℃×30sec，60℃×30sec，72℃×30 sec，進行22次循環；72℃延伸10min，RT-PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定．

2 結果

2.1 鳡β-actin部分編碼序列的擴增

以鳡肌肉總RNA為模板，進行逆轉錄反應，再用引物BactinF/ BactinR進行PCR擴增，PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.電泳檢測結果（見圖1）顯示，得到460bp PCR擴增產物，與設計的目的片段長度相一致，經測序后獲得了該片段的核苷酸序列，與其他物種的β-actin基因進行比對，確認該序列為鳡β-actin基因編碼區的部分序列．

2.2 鳡β-actin基因的5′-RACE和3′-RACE擴增

以鳡肌肉總RNA為模板，經5′-RACE和3′-RACE的各兩輪PCR，分別獲得約在800bp和1.2kb較亮的條帶，與試驗預期的結果接近(見圖2).通過對上述兩個片段回收后克隆到pMD-18T載體中，經測序后獲得了該兩個片段的核苷酸序列，與其他脊椎動物的β-actin基因比對，確認這兩條序列分別為鳡β-actin基因的5′和3′端序列．

2.3 鳡β-actin基因全長cDNA和氨基酸的序列分析

經克隆后測序和拼接，獲得全長為1775bp的β-actin cDNA序列，其中包含1128bp的開放性閱讀框，其起始密碼子是ATG，終止密碼子是TAA，編碼375個氨基酸，5′-UTR區為98bp，3′-UTR區為549 bp，polyA加尾信號AATAAA位于1740bp（見圖3）．

鳡β-actin核苷酸及氨基酸序列與其他物種進行同源性比較發現，鳡β-actin與魚類、哺乳類、鳥類和兩棲類的氨基酸同源性在97%以上，核苷酸的同源性為85%至98.85%不等.鳡β-actin的核苷酸和氨基酸與鯉形目類的硬骨魚同源性較高，均在98%以上，其中與團頭魴的核苷酸和氨基酸同源性最高，分別為98.94%和99.73%，與其他魚類的同源性次之，與哺乳類和兩棲類相對較低（見表1）.

2.4 β-actin的系統發育分析

根據所獲得的鳡β-actin基因CDS核苷酸序列，采集GenBank中其它物種包括人(Homo sapiens)（X00351.1）、牛(Bos Taurus)(AY141970.1)、小鼠（Mus musculus）（NM_007393.3）、紅原雞(Gallus)（NM_205518.1）、火雞（Melea?gris gallopavo）（AY942620.1）、團頭魴（AY170122.2）、鯉魚（Common carp）（M24113.1）、草魚（Grass carp）(M25013.1)、鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）（AF301605.1）、斑馬魚（Danio rerio）（AF057040.1）、斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）（AY510710.2）、大西洋鮭（Salmo salar）（AF012125.1）、羅非魚（Tilapia mossambica）（AB037865.1）、松江鱸（Trachidermus fasciatus）（HM449124.1）、非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）（BC082343.1）等脊椎動物的β-actin核苷酸序列，利用MEGA4.1軟件構建了鳡和以上16種脊椎動物的β-actin基因分子進化樹（見圖4）.結果表明鳡β-actin與團頭魴、鯉魚、鰱魚和草魚聚類在一起，形成一個鯉形目魚類分支，且有較高的自展值．2.5 鳡β-actin基因的組織表達分析

圖1 鳡β-actin基因部分序列RT-PCR產物的1%瓊脂糖凝膠電泳結果

圖2 鳡β-actin基因cDNA 5′-端和3′-端序列的5′-RACE和3′-RACE擴增結果

表1 鳡與其它動物β-actin基因編碼區同源性比較

續表1

采用 RT-PCR方法檢測了β-actin基因mRNA在鳡腎臟、腸、鰓、心臟、肝臟、腦和肌肉等7個不同組織的表達情況．通過PCR條件優化，β-actin基因在擴增進入平臺期前的循環數為22次，電泳結果顯示（見圖5），在約460bp獲得β-actin特異性片段，與預期設計的試驗結果相符，并發現這7個組織均有β-actin基因 mRNA的表達，并在表達量上基本一致．

3 討論

圖4 不同物種推導的β-actin核苷酸酸序列構建的NJ樹（數字表示bootstrap值）

本研究成功地克隆了鳡β-actin的全長cDNA基因1775bp，其中5′非翻譯區（5′-UTR）為98bp，3′非翻譯區（3′-UTR）為549bp，1128bp的開放閱讀框（ORF），起始密碼子為ATG，終止密碼為TAA，共編碼375個氨基酸，在1740bp處存在AATAAA的polyA加尾信號序列.經過β-actin核苷酸和氨基酸的同源分析，發現鳡與、牛、小鼠、紅原雞、火雞、團頭魴、鯉魚、草魚、鰱魚、斑馬魚、斜帶石斑魚、大西洋鮭、羅非魚、松江鱸、非洲爪蟾等脊椎動物的同源性較高，核苷酸同源性在88%以上，氨基酸的同源性在97%以上，說明脊椎動物的β-actin基因在進化過程中是非常保守的，氨基酸的同源性尤為保守.由于蛋白質的進化信息較少，因此如以β-actin蛋白質作進化分析，則可靠性較差.所以本文以核苷酸為研究對象進行進化分析，建立的進化樹能較準確地展示魚類、哺乳類、鳥類和兩棲類四類脊椎動物的親緣關系.鳡β-actin與鯉形目的團頭魴的同源性最高，親緣關系最近，這和傳統的分類相符.β-actin基因能從種群層次上反映出脊椎動物的進化規律，表明其可成為研究類群進化的重要參考分子．

肌動蛋白是構成真核生物細胞骨架和肌小節的主要成分，在維持細胞結構、細胞運動和細胞分裂等細胞生理活動方面發揮著重要的作用.β-actin為肌動蛋白家族中的重要成員，屬細胞質型肌動蛋白，在各組織中呈恒量表達[1，2，6].RT-PCR分析發現，鳡β-actin基因的mRNA在所采集的肌肉、心臟、肝、腎、腦、鰓和腸7個組織中均有表達，因此β-actin基因可以作為研究鳡其他基因表達的內參標準.鳡β-actin基因的全長cDNA的克隆及表達研究為進一步研究其在鳡生長、發育方面的生物學功能與其調控序列的研究奠定了基礎，也為鳡其他基因的研究打下一定的物質基礎．

圖5 鳡β-actin基因表達檢測結果

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