毛囊干細胞定向分化過程中Wnt信號通路介導的基因調控

向萌娟 綜述 楊 斌 審校

·綜述·

毛囊干細胞定向分化過程中Wnt信號通路介導的基因調控

向萌娟 綜述 楊 斌 審校

皮膚的毛囊干細胞具有自我復制以及多向分化潛能，在毛囊形態發育和定向分化過程中，Wnt信號通路起決定性作用。參與這條信號通路的重要蛋白質，如Wnt蛋白、Frizzled、β-catenin、GSK3β、APC、Axin等研究相對較早，且頗為深入。但對于這條通路下游的調節因子，尤其是細胞核內關鍵性轉錄因子Tcf3、Lef1，以及它們所調控的一些重要基因c-myc、cyclinD1等的研究仍處于起步階段。本文就Wnt信號通路介導的基因調節毛囊干細胞定向分化的研究現狀進行綜述，為構建組織工程皮膚提供理論參考。

毛囊干細胞 Wnt信號通路 基因調控

皮膚細胞每天都在不停地更新。表皮層細胞凋亡脫落，由表皮基底層干細胞不斷產生新的細胞上移補充，干細胞逐漸演化成終末細胞，增殖與分化之間保持著相對平衡。表皮含有兩種可增殖的角蛋白細胞，即干細胞（Stem cell）和短暫擴充細胞（Transit amplifying cells，TAC）。干細胞也稱標記儲留細胞（Label-retaining cell，LRC），是一類具有無限自我更新和高度增殖能力的細胞群。短暫擴充細胞由干細胞分化而來，并能進一步分化成終末分化細胞而退出細胞周期[1－2]。以往的研究基本明確了毛囊干細胞的定位、特異性標記物、生長微環境等[3-5]。但毛囊干細胞是如何定向分化的？生物信號如何調節基因表達來控制毛囊干細胞的命運？本文就毛囊干細胞定向分化中Wnt信號介導基因調控的研究進展進行綜述。

1 Wnt信號通路

1.1 Wnt信號通路的概述

Wnt信號通路包括經典Wnt信號通路，即Wnt/β-catenin信號通路；以及10個非經典Wnt信號通路：Wnt/PCP信號通路、Wnt-cGMP信號通路、Ca2+信號通路等。參與毛囊干細胞增殖分化的信號通路主要為經典Wnt信號通路。在胚胎的生長發育以及成體干細胞的增殖分化過程中，這條通路將細胞外或細胞間的信息傳遞到細胞核內，并通過一系列級鏈反應影響著基因的表達，從而對細胞的分化方向、細胞增生、細胞極性及遷移、細胞老化等進行調控。不僅如此，最近的研究還表明，Wnt信號通路在調節干細胞多能性以維持機體內穩態上也發揮了關鍵性的作用[6]。

1.2 Wnt蛋白及β-catenin

Wnt蛋白家族是一個及其復雜龐大的信號系統，包含有多個亞類。哺乳動物有19個Wnt蛋白基因，可以產生12個Wnt蛋白亞家族[7]。人類至少存在有19個Wnt家族成員，其中包括Wnt-3、4、5a、6、7a、7b、10a、10b、11等。Wnt蛋白進入細胞內引起級鏈反應的關鍵分子之一便是β-連環蛋白 （βcatenin）。β-catenin是 1980年Walt Birchmeier在研究細胞黏附分子—E-鈣粘連素 （E-cadherin）相關分子時首次發現的。β-catenin基因位于3p21，由CTNNB1基因編碼，其產物在人體的相對分子質量約92 KDa。從低等動物果蠅至哺乳動物和人類，其同源性高達80%，具有高度的進化保守性。βcatenin有 3個重要的功能域：N末端為糖原合酶激酶 3（GSK3β）磷酸化降解區，對于調節 β-catenin的穩定性有重要作用；C末端是轉錄激活域，可與轉錄活化因子TCF/LEF結合；中間的連接臂重復區是arm重復域，是β-catenin與多種配體如腫瘤抑制基因結腸腺瘤息肉病基因蛋白 （APC）、軸素（Axin)、E-鈣粘連素等結合的重要部位。

已有的研究表明，β-catenin在毛囊干細胞的激活及定向分化中起關鍵作用。β-catenin具備兩方面的生物學功能，黏合連接與信號轉導[8]。Wnt信號通路靜止時，β-catenin只參與細胞間的黏合連接；當Wnt信號通路啟動時，β-catenin起核心信號分子作用。毛囊干細胞內表達高水平的β-catenin時，干細胞分化成為毛囊結構的細胞，而低水平的β-catenin將使毛囊干細胞分化成為表皮細胞。此外，有研究表明，成人表皮中的β-catenin被激活后，會有新的毛囊形成[9]，而在毛囊隆突部干細胞群的β-catenin表達沉默后，會引發毛囊干細胞向表皮細胞轉歸。有研究認為，通過轉基因表達[10]或者創傷而提高穩定的β-catenin含量，也將誘導皮膚產生新的毛囊；反之，丟失β-catenin后毛囊也隨之缺失，皮膚腫瘤生長受到抑制[11]。

1.3 Wnt蛋白與受體的相互作用及信號通路

在經典Wnt信號通路中，無Wnt信號刺激時，細胞質中的β-catenin與Axin、GSK3β、APC、酪蛋白激酶1（Casein kinase 1，CK1）等結合在一起構成降解復合體，β-catenin的第41、37、33位殘基被GSK3β絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，第45位殘基被CK絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，受到泛素的共價修飾而被蛋白酶降解，從而保持了胞內低水平的β-catenin。隨著Wnt蛋白的增加，Wnt蛋白與細胞膜上跨膜的卷曲蛋白受體Frizzled（FZ）及低密度脂蛋白受體相關蛋白（Low density lipoprotein receptor-related protein，LRP）結合，激活了細胞質中的散亂蛋白（Dishevelled，DSH）。DSH與Axin作用并添加上其它蛋白質，如GSK結合蛋白 （GBP/FRAT）以及蛋白磷酸化酶2C，抑制了Axin·APC·GSK3β復合體的形成，降低了GSK3β的活性，抑制β-catenin的磷酸化，阻斷細胞質中的泛素-蛋白酶小體對游離β-catenin的降解，從而引起細胞質內βcatenin的水平升高。細胞質內低磷酸化的β-catenin聚集，濃度升高進入細胞核，與T細胞因子（T cell factor，TCF）/淋巴樣增強因子（Lymphiod enhancer factor，LEF）形成復合體，作為細胞核轉錄激動劑來調節靶基因的轉錄。

2 Wnt信號通路介導的基因調控

TCF/LEF轉錄因子家族是含有HMG結合域的DNA連接蛋白，為Wnt信號通路重要的下游效應因子。大部分TCF/ LEF分子含有3個主要的結合域：N端的β-catenin結合域、Groucho/TLE結合域以及連接DNA的HMG結合域。在Wnt信號通路中，Wnt蛋白存在時，β-catenin轉移定位于細胞核，替換掉結合在TCF/LEF上的四聚物Groucho（Grg/TLE），形成β-catenin-TCF/LEF二聚體，并能引導更多的激活因子聚集在該二聚體上，激活下游靶基因c-myc、cyclin D1、Tcf1和PPARδ等的轉錄與表達，調節細胞的增殖和分化，調控細胞的命運。但在替換過程中，能否形成β-catenin-TCF/LEFGroucho/TLE-DNA中間態復合體，目前仍沒有明確的報道。

2.1 Wnt信號通路下游的重要轉錄因子

脊椎動物TCF轉錄因子家族成員包含4個：Tcf1、Lef1、Tcf3和Tcf4[12]。在毛囊的誘導分化中起到重要作用的是Tcf3和Lef1。Tcf3在隆突部（Bulge）及外根鞘（ORS）下份的干細胞中表達豐富且含量不同，Bulge區干細胞通常只表達Tcf3而不表達Lef1，毛囊干細胞呈現靜止狀態，而ORS中的毛囊干細胞表現出激活的狀態，能進一步作為替補細胞出現在毛囊的基底層，形成基底細胞和毛發[13]，Tcf3在ORS中表達相對減少；Lef1則主要表達于毛囊基底細胞中，這些細胞可定向分化為短暫擴充細胞、前皮質細胞，長出毛發。當隆突部細胞向毛囊基底細胞分化時，TCF3丟失，而LEF1表達出現，這一轉變似乎在干細胞向毛發細胞分化的過程中是必須的，可能與接受了Wnt信號傳導有關。

當穩定表達的β-catenin水平增加時，干細胞激活，許多細胞增殖相關的基因表達隨之上調，毛囊毛發生長發生[14]。大量的實驗證明，Tcf3在缺乏Wnt信號的情況下，可抑制毛囊干細胞的定向分化，使毛囊干細胞保持其多向分化潛能；Wnt信號參與時，Tcf3則能介導毛囊干細胞分化。Lef1必須在有Wnt信號存在的情況下才能發揮作用，促進毛囊干細胞分化成為構成毛囊結構的細胞，在毛囊的形態發生中起著至關重要的作用。異位誘導Tcf3表達于表皮的基底層，將會抑制表皮基底層細胞分化為表皮細胞，并能改變轉錄使之成為類似于胚胎的非定向分化的表皮結構[15]。另外，Tcf3在細胞周期中也起到減慢細胞循環的作用。Lef1的顯性負突變能夠導致Lef1或β-catenin過度表達，然后引起 β-catenin信號通路阻斷，對Wnt信號通路產生負性調節作用，抑制毛囊濾泡分化，導致毛囊形成異常；但卻促進了毛囊干細胞向皮脂腺和毛囊濾泡間上皮分化。同時，過度表達的Lef1還可引起毛囊腫瘤的發生[16]。

Tcf3能抑制Wnt信號通路靶基因的轉錄，保持毛囊干細胞多向分化能力的特性，可以通過其他一些標記物的共同表達得到進一步的說明。在一些動物模型中，表達Tcf3的表皮還能出現K5、SOX9等相對未分化形態學的陽性表達，說明Tcf3能保持細胞的干性。Tcf3的這些作用也可用來解釋為什么Tcf3局限于毛囊的Bulge區表達，這與Bulge區細胞的自我更新、慢周期特性是一致的。

Lef1和β-catenin在毛囊的形態學發生中起著重要的作用。早在1994年，就有研究發現Lef1陰性的大鼠表現出毛囊的缺乏。進一步研究發現，利用角蛋白14（Keratin 14）為啟動子載有 Lef1基因的載體在轉基因大鼠的表皮、ORS以及Bulge區表達Lef1以后，在表皮也能觀察到類似于毛芽樣的內陷，即產生了代表毛發的信號。當以同樣方法利用K14為啟動子表達結構穩定的 β-catenin（ΔN87β-catenin）以后，來自于表皮、ORS以及Bulge區的細胞發生毛囊樣分化，并有毛囊形態學發生。在這些轉基因大鼠中，Lef1的表達與毛囊干細胞向毛囊毛發分化是一致的，說明了Lef1對于毛囊干細胞定向分化的調節起到至關重要的作用。

最近的研究發現，無論是在胚胎祖細胞還是出生后的毛囊干細胞中，Tcf4與Tcf3都是共同表達的，而且Tcf4的表達位置和作用都與Tcf3一致，都能抑制毛囊干細胞的分化，保持毛囊干細胞的多能性[17]。

在人類和鼠科動物中，編碼的Groucho蛋白同系物分別被命名為TLE1-4、hAES和Grg1-5，其中TLE1-4與Grg1-4包含Goucho蛋白全長的5個結構域，即Q、GP、CCN、SP和WD40，而hAES和Grg5只有Q、GP兩個結構域。Goucho蛋白通過其N末端Q域的亮氨酸拉鏈組成四聚體結構，可與組蛋白去乙酰化酶相互作用。在核內沒有β-catenin的情況下，Groucho連接在TCF/LEF上，聚集的組蛋白去乙酰化酶會使染色質更加緊密而失活。當Wnt信號存在時，β-catenin在核內聚集，與β-catenin的酸性 C末端直接相連的蛋白CBP/ p300[18]發生反應，CBP/p300有組蛋白乙酰化酶活性，可使連接在TCF/LEF上的DNA激活，抵消Groucho/TLE的作用[19]，協助β-catenin轉錄下游靶基因。近年來的研究發現，CtBP既可作為共激活因子也可作為共抑制因子，它表現出什么樣的活性依賴于細胞的表型，但這一系列反應的具體過程目前仍不清楚。

2.2 TCF/LEF與β-catenin

Merrill等[20]的轉基因小鼠實驗中，無論是野生型的TCF3，還是N端β-catenin結合域缺失的TCF3（ΔNTcf3），均能起到相同的作用，即抑制靶基因的轉錄產生相同的表型，說明Tcf3的作用可能并不依賴于β-catenin信號。Merrill等[21]的胚胎實驗也發現，在胚胎的形成過程中，Tcf3與TCF/LEF家族的其他成員是不相同的，無論有沒有Wnt信號，Tcf3均可發揮其調節基因的作用。但與TCF3不同的是，Lef1對于轉錄的激活必須依賴Wnt信號及穩定的 β-catenin存在。N端βcatenin結合域缺失的Lef1（ΔN Lef1）由于無法與β-catenin結合，阻止了Lef/Tcf的激活功能，毛發形成被終止，代之形成皮脂腺細胞。

目前對于β-catenin是如何進入細胞核內的機制尚不明確。但通過使TCF過度表達發現，當存在有大量TCF時，βcatenin進入細胞核內變得相對容易。利用逆轉錄病毒轉染角化細胞，使細胞表達不同的β-catenin突變體。研究結果表明，氨基酸截短的β-catenin突變體（因沒有GSK3結合位點而不被降解）可增加培養細胞中干細胞克隆的比例，而且這種作用與TCF/LEF轉錄因子活性改變密切相關。當轉基因小鼠表皮基底層過度表達氨基酸截短的β-catenin時，基底細胞呈現多能干細胞的特征，并可分化形成毛囊和表皮。相反，干細胞中β-catenin表達減少時，則無法分化形成毛囊中的角化細胞，而只向毛囊之間分布的表皮方向發展。雖然βcatenin/TCF3、β-catenin/LEF1復合體與毛囊干細胞增殖、分化間的關系已有了初步的認識，但其潛在機制及功能重要性仍有待進一步研究闡明。

2.3 TCF/LEF調節基因轉錄的影響因素

細胞質與細胞核中catenin伴侶分子的相互競爭影響著TCF/LEF與β-catenin之間的連接。鈣黏素的胞外部分含有五個與Ca2+連接的結構域，與相鄰的細胞緊密連接，而其胞內部分則與 β-catenin、α-catenin、γ-catenin、 細胞骨架及catenin p120緊密連接。過度表達鈣黏素將導致大量的βcatenin之間及β-catenin和鈣黏素之間相互黏連，這樣就減少了β-catenin進入核內與TCF/LEF形成復合體的機率，轉錄受到抑制，靶基因的表達減少。生長因子受體及酪氨酸激酶可以下調鈣黏素的轉錄水平或分解鈣黏素/catenin復合體，從而使β-catenin與E-鈣黏素和細胞骨架脫離，細胞間黏附減弱，有利于Wnt信號的轉導及細胞的遷移和分化[22]。

轉錄因子之間也存在著競爭。β-catenin除了與TCF/LEF結合外，其他的一些活性域可與另外的轉錄因子相結合。如HGM活性域可與SOX亞家族的轉錄因子成員結合，而Arm重復序列區則能與視黃醛受體（RARα）結合。TCF/LEF家族成員種類繁多，作用各不相同，其成員之間與β-catenin的競爭也是影響轉錄的重要因素。另外，與β-catenin高度同源的plakoglobin(γ-catenin)也可競爭性地結合轉錄因子。

ILK（integrin-linked kinase）可以與 β-catenin結合而發生作用，從而調節β-catenin從胞漿轉運到核內的過程，下調GSK-3β的活性，下調E-鈣黏素導致β-catenin的重新分布，ILK還能參與調節Lef1的表達[23]。一些外來因素，例如角質細胞生長因子（KGF）、氯化鋰（LiCl）等也可與TCF/LEF發生作用影響靶基因的轉錄。Fathke等[24]通過采用小鼠背部全厚皮膚缺損的模型，檢測在創傷修復過程中不同時間段的Wnt蛋白表達情況，并用β-gal報告β-catenin的表達，發現LiCl可抑制GSK3β的活性，從而激活β-catenin/Tcf信號通路，部分樣本觀察到皮膚附屬器的形成，包括簡單的毛囊和皮脂腺結構。

3 Wnt信號通路中的關鍵調控基因

3.1 c-Myc

c-Myc是原癌基因Myc家族中的一員，基因定位于8號染色體長臂上（8q24），編碼由349氨基酸組成的蛋白質。其編碼的蛋白質能與核內的DNA特異結合行使轉錄調節功能。c-Myc是Wnt信號通路下游的靶基因，在毛囊上皮的基底膜和毛囊隆突部高表達。當β-catenin信號到達時將促進c-Myc基因表達的啟動，使細胞從G1期向S期轉變，調節細胞周期、抑制β1整合素的表達。在無干細胞存在的其他上皮如濾泡間上皮中，過度表達的Myc則能誘導增殖，抑制分化。簡言之，c-Myc在毛囊干細胞中表達可促進細胞分化成為皮脂腺和表皮[25]，而在其他類型細胞中則促進細胞生長、增殖和凋亡。毛囊干細胞在其微環境中的正常存在依賴于c-Myc的正常表達，c-Myc轉錄水平的下降會導致干細胞衰竭，使干細胞無法參與創面修復過程；而其高表達則抑制角質形成和創面修復過程[26]。采用轉基因大鼠c-Myc-ERTM過量異位表達人的c-Myc基因于毛囊和表皮的基底層，發現這些轉基因大鼠表皮增厚，皮脂腺增大，毛發周期失調[27]。表明c-Myc基因的失控會使干細胞脫離微環境分化成短暫擴增細胞，從而影響皮膚及其附屬器官的正常更新。

c-Myc在不同的細胞中其表達量也不相同。在毛囊干細胞中表達較低，在短暫擴充細胞中表達水平較高，然而到了終末細胞時，其表達水平及轉錄的mRNA數量又下降。這樣才能確保TAC能夠繼續進入細胞周期，進行數次快速分裂，擴充細胞數量，并刺激其分化成為終末細胞[28]，而c-Myc低表達的終末細胞分化能力下降。這也可用來解釋毛囊干細胞與短暫擴充細胞相比，更具有多向分化潛能，而終末分化細胞的分化潛能已經喪失。

由于c-Myc原癌基因啟動子上有Tcf4結合位點，Wnt信號轉導通路中的關鍵組分β-catenin還可能通過與TCF4的結合，而啟動c-Myc原癌基因誘導干細胞分化，這與上述Wnt信號轉導通路中β-catenin主要促使干細胞的增殖作用之間似乎相互矛盾，故而可以推測兩者之間可能存在特殊的反饋環路[29]。另外，大量動物模型證明c-Myc與β-catenin之間存在著相互排斥的作用。這與c-Myc基因激活促進毛囊干細胞向皮脂腺和毛囊間表皮分化，β-catenin誘導新生毛囊發生是一致的[30]。

3.2 cyclin D1

細胞周期蛋白D1（cyclin D1）是調節細胞進入細胞周期增生期的主要因子，通過相應的周期素依賴性激酶（在皮膚主要為CDK4、CDK6）及其抑制因子對細胞周期關鍵限制點的G1/S轉換起正性調節作用，促進細胞由靜止期進入增殖期，激活干細胞使之增殖、分化。cyclin D1基因也是 βcatenin/Lef1復合體的目的基因，Lef1分子上含有 cyclin D1結合位點，與cyclin D1的啟動子結合激活cyclin D1基因的表達以及細胞的增殖。通過在毛囊基底及基底以上區域取樣進行一系列研究發現，cyclin D1編碼的mRNA在整個基底上區層都高于基底區，而且在免疫組化染色中這一差異呈線形，說明cyclin D1介導的細胞增殖主要發生在最接近Bulge區的細胞，同時也能說明cyclin D1在細胞退出干細胞環境的過程中發揮著重要的作用[31]。cyclin D1合成異常將會導致細胞生長循環即使在沒有生長因子的情況下也能發生，并能啟動其他原癌基因的表達。cyclin D1蛋白含量的高低是由多種因子共同調節的，主要通過泛素的靶向降解而減少，過度表達β-catenin可誘導cyclin D1的活性，然而過度表達鈣黏素的胞漿區則能減弱其活性。有研究表明，在轉基因小鼠的表皮單獨表達過量cyclin D1、D2或D3，僅僅只會導致表皮的增生，而不會產生腫瘤。

4 展望

毛囊干細胞作為種子細胞應用于組織工程中，構建具有生物活性的皮膚，并應用于臨床以治療脫發、燒創傷、瘢痕性禿發等毛囊皮膚缺損，已經成為近年來研究的熱點。對于毛囊干細胞的研究，大多數研究都致力于定位、鑒定及增殖分化等，生物信號介導基因調控其定向分化的研究還處于初始階段。Wnt/β-catenin-TCF/LEF路徑是毛囊干細胞重要的生長調控信號，Wnt信號通路中各種生物大分子、受體、配體和無機分子之間相互作用而產生的生物學效應，TCF/LEF以及下游調控的靶基因c-Myc、cyclinD1的表達對于干細胞的增殖都具有極其重要的作用。隨著基因組研究、基因工程技術的不斷進步，將能夠進一步解釋毛囊干細胞基因表達調控機制從而通過有效的方法使其向人們需要的方向分化。

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Gene Regulation by Wnt Signaling Pathway in the Oriented Differentiation of Hair Follicle Stem Cells

XIANG Mengjuan1,YANG Bin2.1 GuangZhou Medical University,Guangdong 510182,China;2 Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100144,China.Corresponding author:YANG Bin(E-mail:ybdoctor_psh@163.com).

Hair follicle stem cells; Wnt signaling pathway; Gene regulation

Q813.1+2

A

1673－0364（2011）04－0181－05

2011年7月11日；

2011年8月20日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.05.001

國家自然科學基金（30772099），北京市自然科學基金（7112111）。

510182 廣東省廣州市 廣州醫學院 （向萌娟）；100144 北京市 協和醫學院中國醫學科學院整形外科醫院（楊斌）。

楊斌（E-mail:ybdoctor_psh@163.com）

【Summary】Wnt signaling pathway plays a decisive role in morphological development and oriented differentiation of hair follicle stem cells(HFSCs)with the ability of self-replication and the potential of multiplex differentiation.Investigation of many important proteins involving in Wnt signaling pathway such as Wnt,Frizzled,β-catenin,GSK3β,APC,Axin has been carried out relatively earlier and deeper.While investigation of some downstream effectors especially the transcription factors located in cell nucleus,like Tcf3,Lef1 and gene c-myc,cyclinD1 regulated by Tcf3 and Lef1 is still at the primary phase. This paper reviews gene regulation of oriented differentiation of hair follicle stem cells by Wnt signaling pathway,so as to provide theoretical reference in tissue engineered skin.